李紅波 彭磊

氧自由基失衡微環(huán)境對骨關(guān)節(jié)炎進展的影響

李紅波 彭磊

氧自由基；自由基；骨關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)疾病

骨關(guān)節(jié)炎 ( osteoarthritis，OA ) 主要表現(xiàn)為病變關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨退行性變、繼發(fā)性骨質(zhì)增生，可累及病變關(guān)節(jié)滑膜、關(guān)節(jié)囊和關(guān)節(jié)其它毗鄰結(jié)構(gòu)[1]，涉及關(guān)節(jié)軟骨的侵蝕、 骨贅形成、軟骨下硬化以及滑膜和關(guān)節(jié)囊的一系列生化和形態(tài)學(xué)改變的慢性遷延性疾病[2]。骨關(guān)節(jié)炎自被發(fā)現(xiàn)以來，其定義一直存在爭議，osteoarthritis 最初由 John Spender 于 1886 年講到類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的更適合名稱時提出的術(shù)語[3]。隨著分子生物學(xué)對骨關(guān)節(jié)炎研究的深入，人們開始重視關(guān)節(jié)軟骨和生物力學(xué)方面的研究。Bennett Waine和 Bauer[4]于 1942 年把關(guān)節(jié)軟骨放在界定 OA 最重要的位置。不同亞學(xué)科如流行病學(xué)、病理學(xué)、影像學(xué)等均從不同角度給予 OA 充分的描述和定義。但對骨關(guān)節(jié)炎目前未有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)定義。目前普遍采用美國骨科學(xué)院 ( American Academy of Orthopaedic Surgeons ) 和美國國家衛(wèi)生研究所( National Institute of Health ) 主辦的國際會議上正式通過的定義[5]：OA 疾病為機械性及生物性因素相互作用，使關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨下骨合成與降解的失衡的結(jié)果。OA 疾病表現(xiàn)為：關(guān)節(jié)軟骨的軟化、纖維化、潰瘍和減少，軟骨下骨硬化和象牙化，骨贅形成和軟骨下骨囊腫。當(dāng) OA 臨床表現(xiàn)明顯時，OA 疾病具有關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、運動受限等癥狀。

OA 發(fā)病原因復(fù)雜，生物應(yīng)力、激素代謝、金屬原子、自由基的失衡、某些細(xì)胞因子等被認(rèn)為與 OA 密切相關(guān)。其中氧自由基被認(rèn)為是 OA 發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，線粒體電子傳遞產(chǎn)生的氧自由基有利于維持細(xì)胞糖酵解的氧化還原平衡，以此保持關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝的動態(tài)平衡[6]。關(guān)節(jié)組織細(xì)胞通過 HIFs 等調(diào)節(jié)來維持微環(huán)境里氧自由基穩(wěn)態(tài)，以維持自身的組織特異性功能、結(jié)構(gòu)[7-9]。此外穩(wěn)態(tài)下的活性氧 ( ROS ) 具有免疫和信號傳導(dǎo)過程等功能，但活性氧自由基失衡會引起多種病理改變。有實質(zhì)性的研究表明活性氧 ( ROS ) 是 OA 軟骨損傷和 OA 的發(fā)展主要原因[10]。亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)與健康人相比 OA 患者紅細(xì)胞內(nèi) SOD ( 超氧化物歧化酶 ) 明顯降低，血漿 LPO ( 脂質(zhì)過氧化物 )含量明顯增高[11]。另有在 OA 患者中發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激水平氧和自由基水平升高[12]。McCord 等[13]提出在 OA 患者中抗氧化防御系統(tǒng)失常是組織易受氧化應(yīng)激損傷并導(dǎo)致關(guān)節(jié)氧化病理損傷重要因素之一。自由基對關(guān)節(jié)軟骨損傷作用逐漸被重視[14-15]。

一、失衡的氧自由基參與炎性反應(yīng)，對細(xì)胞、組織產(chǎn)生直接損傷

氧自由基由于其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)對機體產(chǎn)生直接損傷作用，它能夠?qū)Π被?、多酞、蛋白質(zhì)等進行化學(xué)修飾進而改變其結(jié)構(gòu)和功能，同時增加對相關(guān)蛋白水解酶的敏感性，促進細(xì)胞表面蛋白的降解，使細(xì)胞膜過氧化[16]。細(xì)胞膜的嚴(yán)重?fù)p傷導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡或壞死。有研究表明氧自由基能增加炎癥反應(yīng)[17]。氧自由基通過激發(fā)一些炎癥介質(zhì)，OA 的發(fā)病中重要的關(guān)鍵炎癥因[10]IL-1β 和 TNF-α 可直接攻擊蛋白多糖、膠原蛋白分子、基質(zhì)蛋白及膜蛋白等導(dǎo)致OA 關(guān)節(jié)處組織細(xì)胞損傷。 有研究表明高水平的 ROS 可導(dǎo)致軟骨退化[18]，通過裂解膠原蛋白、聚集蛋白聚糖和激活基質(zhì)金屬蛋白酶 ( MMPs ) 導(dǎo)致細(xì)胞壞死[19]。體外培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)：正?；ぜ?xì)胞產(chǎn)生微量的 IL-1，而 OA 患者的滑膜細(xì)胞分泌 IL-1 量升高。IL-1 是重要的炎性介質(zhì)，它可激發(fā)多種炎性反應(yīng)如刺激滑膜增生、產(chǎn)生膠原酶及前列腺素E2，增加溶質(zhì)素分泌，促進滑膜細(xì)胞黏附因子的高表達，其結(jié)局加重 OA 炎性損傷病變[20]。IL-1 可誘導(dǎo) T 細(xì)胞分泌 IL-2 促進 B 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo) T、B 細(xì)胞前體分化，增強NK 細(xì)胞的殺傷作用及巨噬細(xì)胞的吞噬功能。氧化應(yīng)激伴隨的一些炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子持續(xù)異常增高會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)反復(fù)，而這可能是最初導(dǎo)致機體組織結(jié)構(gòu)的破壞和功能障礙促進 OA 發(fā)展的原因之一。

二、氧自由基影響 OA 患者軟骨細(xì)胞及組織的修復(fù)、彈性模量及結(jié)構(gòu)

1.相關(guān)生物影響因子：氧自由基可抑制軟骨基質(zhì)蛋白多糖的合成、促進蛋白多糖和膠原的降解也影響了 OA 的遷延和發(fā)展[15]。體外研究表明[21]，軟骨細(xì)胞在高濃度的自由基環(huán)境下，合成和分泌蛋白多糖和膠原的功能發(fā)生改變：蛋白多糖合成減少，膠原的分泌由 II 型轉(zhuǎn)變?yōu)?I 型，這些異常改變都是軟骨損傷退變的基礎(chǔ)。亦有研究發(fā)現(xiàn)失常的自由基可抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 DNA、基質(zhì)蛋白、多糖及膠原的合成，同時嚴(yán)重?fù)p傷軟骨細(xì)胞[14]。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的一些炎癥反應(yīng)因子如 TNF ( 腫瘤壞死因子 ) 可進一步促進軟骨細(xì)胞產(chǎn)生過氧化反應(yīng)[13]，誘導(dǎo)膠原酶的產(chǎn)生、PGE的釋放及增加蛋白酶活性。Donohue 等[22]提出，OA 患者體內(nèi)的非特異性抗體可抑制軟骨細(xì)胞 DNA、硫酸多糖和膠原的合成，加重軟骨損傷與退變。過多軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)的暴露可再次激發(fā)自身免疫反應(yīng)。自由基對軟骨細(xì)胞的損傷不僅體現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)狀態(tài)上的改變，細(xì)胞功能也有所改變。

2.氧化應(yīng)激導(dǎo)致軟骨細(xì)胞修復(fù)失常：OA 患者主要表現(xiàn)為軟骨下的改變[23]、關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成。體外研究表明氧化損傷和關(guān)節(jié)軟骨變性之間存在相關(guān)性[24]，氧化應(yīng)激導(dǎo)致軟骨細(xì)胞端粒不穩(wěn)定且異化的軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)和成分發(fā)生變化。氧自由基誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定包括端粒不穩(wěn)定和人類軟骨細(xì)胞復(fù)制衰老和功能障礙。雖然活性氧 ( ROS ) 作為細(xì)胞內(nèi)第二信使分子[25]參與生物過程的各個方面，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致線粒體退化的主要因素，它會導(dǎo)致氧化鏈和線粒體基因組顯著損傷并且降低線粒體 DNA 的修復(fù)能力[26]。與氧化應(yīng)激損傷相關(guān)的遺傳物質(zhì)的損傷或失常引起基因調(diào)控和表達的紊亂可能是 OA 患者自我修復(fù)及結(jié)構(gòu)異常、組織彈性模量減弱及應(yīng)力反應(yīng)性失常、結(jié)構(gòu)機能異常( 可能遵循 wolff 定律 ) 這種惡性循環(huán)的分子水平基礎(chǔ)。在OA 關(guān)節(jié)腔低氧微環(huán)境下，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中 HIF- 1α 誘導(dǎo)的VEGF 表達明顯增高，且與 OA 的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[27]。Chang 等[28]通過長期的研究證實了低氧可以在多方面影響和調(diào)節(jié) OA 軟骨下骨的硬化及骨贅生成。在 OA 炎性浸潤的微環(huán)境中高水平的氧化應(yīng)激損害 MSC 軟骨分化、導(dǎo)致新生軟骨的降解[10]。而這大大減弱了到軟骨細(xì)胞自生修復(fù)能力。正常關(guān)節(jié)負(fù)載時，軟骨變形，拱形纖維結(jié)構(gòu)承受沿膠原纖維方向傳導(dǎo)的壓力，并分散到軟骨下骨。卸載時，壓力消失，纖維回復(fù)到原狀，在這一過程中，軟骨細(xì)胞始終在纖維網(wǎng)格內(nèi)受到保護[21]。正常的負(fù)載會導(dǎo)致軟骨的應(yīng)力改變。而應(yīng)力的改變 ( wolff 定律 ) 或 OA 患者遺傳物質(zhì)的異常表達進一步導(dǎo)致結(jié)構(gòu)異常。而整個修復(fù)系統(tǒng) ( 包括去除異常，修復(fù)正常的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)功能 ) 的失常導(dǎo)致這種錯誤能保留甚至持續(xù)。

三、氧自由基失衡影響軟骨細(xì)胞凋亡、自噬

正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率極低 ( 2%～5% )，而 OA 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率則明顯升高為 18%～21%，說明軟骨細(xì)胞凋亡參與 OA 的發(fā)生和發(fā)展過程[29]。增加軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)與人類 OA 軟骨損傷的嚴(yán)重程度。凋亡軟骨細(xì)胞在軟骨損傷更頻繁地發(fā)現(xiàn)比在非損傷區(qū)域[30]。

細(xì)胞凋亡受基因調(diào)控，其途徑主要有兩條，一條是通過細(xì)胞膜上的死亡受體激活半胱氨酸蛋白酶 caspase，另一條是通過胞質(zhì)內(nèi)的線粒體途徑釋放細(xì)胞凋亡因子激活半胱氨酸蛋白酶 caspase[31]。這些活化的 caspase 可將細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白降解，引起細(xì)胞的凋亡。有研究表明[32]AGEs 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷引起線粒體功能的損傷，同時AGEs 可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)[33-34]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的最重要的變化是細(xì)胞內(nèi)線粒體 Ca2+的增加。在線粒體中增加的 Ca2+會破壞電子傳遞鏈和活性氧的存在，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生。ROS 產(chǎn)生促進 AGEs，進而促進細(xì)胞色素 C 的釋放，細(xì)胞色素 C 是凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它在 dATP 存在下與 Apaf-1 結(jié)合進而激活 caspase-9，caspase-9 作為 caspase家族調(diào)控凋亡的中心環(huán)節(jié)，它的活化會進一步激活其它 caspase 如 caspase-3 等活性導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[33]。Yu 等[35]研究發(fā)現(xiàn) W FA 誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) ROS 的產(chǎn)生如增加 DCF 染色的細(xì)胞群，且過多的氧自由基通過激活 P13K / Akt 以及 JNK 通路調(diào)節(jié) W FA 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。

有研究表明 OA 的后期階段缺乏自體吞噬和增加的細(xì)胞凋亡可與軟骨細(xì)胞異常鈣化及軟骨損傷相關(guān)聯(lián)[36]。OA發(fā)病期間凋亡和自噬是復(fù)雜的，在初期階段 OA 的自噬大概可以被激活作為避免了細(xì)胞死亡的一種適應(yīng)性反應(yīng)，而在 OA 的后期，這個過程也可以相互結(jié)合與細(xì)胞凋亡活化作為替代途徑細(xì)胞死亡[37]。

四、氧自由基的失衡影響遺傳物質(zhì)的表達及調(diào)控

1.失衡的氧自由基對 DNA 的損傷：在 OA 患者中，自由基的過度表達導(dǎo)致 DNA 的損傷進而影響關(guān)節(jié)損傷及修復(fù)，這也可能是骨關(guān)節(jié)炎進展中分子水平的關(guān)鍵因素。有文獻報道[38]，OA 患者軟骨細(xì)胞 DNA 中 8-羥基 -2’- 脫氧鳥苷 ( 8-OHdG ) 明顯增加。8-OHDG 是活性氧自由基如羥自由基、單線態(tài)氧等攻擊 DNA 分子中的鳥嘌呤堿基第8 位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性加合物，可作為內(nèi)源性及外源性因素對 DNA 氧化損傷作用的生物標(biāo)志物。DNA 鏈斷裂和 8-OHdG 的增加，導(dǎo)致受累的模板錯讀，引起點突變，使細(xì)胞存活力下降。活性氧自由基 ( ROS ) 可直接攻擊 DNA，使其發(fā)生氧化性損傷。增高的 8-OHdG 能引起DNA 復(fù)制過程的錯讀，喪失堿基配對的特異性，引起相鄰的嘧啶堿基錯誤復(fù)制[39]。自由基介導(dǎo) DNA 的損傷，氫氧基在 DNA 內(nèi)引起堿基和糖基的改變[40]。有研究表明骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞 DNA 低分子片段增加，出現(xiàn)典型的類似酶切的細(xì)胞凋亡梯形改變，氧自由基對信號傳導(dǎo)及遺傳物質(zhì)的影響在啟動細(xì)胞調(diào)亡中發(fā)揮作用[38]。此外有研究表明過高 ROS 會增加 OA 軟骨細(xì)胞中 mtDNA 損傷進而增加軟骨細(xì)胞對 IL-1β 和 TNF-a 的敏感性[41]。OA 軟骨細(xì)胞線粒體 DNA 的完整性和線粒體 DNA 修復(fù)能力減弱伴隨OA 的遷延、發(fā)展。

2.失衡的氧自由基導(dǎo)致 mic-RNA 水平明顯變化：研究表明表觀遺傳修飾在 OA 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[42]。表觀遺傳學(xué)研究與 DNA 序列無關(guān)的基因表達調(diào)控，包括 DNA 甲基化、組蛋白修飾、mic-RNA、基因印記等。表觀遺傳調(diào)控特別是 mic-RNA 的調(diào)控可作為研究 OA 發(fā)病機制的新思路。研究人員應(yīng)用免疫學(xué)檢測方法對 OA 患者軟骨中的 Ec-SOD 分布進行測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)中的含量明顯降低，而細(xì)胞內(nèi)含量則相對較高[43]，氧自由基的失衡所伴隨的 mic-RNA 水平明顯變化使得一些學(xué)者開始重視氧自由基對 mic-RNA 的影響導(dǎo)致OA 的損傷與失修復(fù)。同時，研究人員還發(fā)現(xiàn)除 EC-SOD的 mic-RNA 水平明顯增加外，其它代表氧化損傷程度的誘導(dǎo)型－氧化氮合成酶和神經(jīng)元型－氧化氮合成酶的含量水平亦有所升高[44]。其中 mic-RNA 作為研究 OA 發(fā)病機制以及作為治療 OA 的新靶點成為當(dāng)前在分子水平對 OA干預(yù)的新熱點。 失衡的氧自由基對 mic-RNA 的影響可以增強 OA 的炎癥反應(yīng)。有研究表明 mic-RNA-146a 能通過抑制 NF-KB 的活性和影響其靶基因的表達來抑制炎癥反應(yīng)[44]。而 OA 患者失常的氧自由基對 mic-RNA-146a 功能影響會減弱這種抑制作用從而使 NF-KB 信號放大，炎癥反應(yīng)增強持續(xù)存在。有文獻報道 mic-RNA 可通過調(diào)控細(xì)胞信號中某些信號分子如轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、生長因子促凋亡和抗凋亡基因的表達來調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和發(fā)育，促進細(xì)胞增殖與分化且調(diào)控細(xì)胞凋亡[45]。Abouheif[46]對小鼠OA 模型的研究表明 mic-RNA-34a 表達受阻可阻止軟骨細(xì)胞的凋亡。

五、抗氧化系統(tǒng)的減弱導(dǎo)致正常氧自由基作用的異常

氧化應(yīng)激在 OA 疾病的發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用，并導(dǎo)致線粒體的變性。有研究發(fā)現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎晚期患者自身抗氧化應(yīng)激能力的降低[47-48]。

軟骨細(xì)胞能夠通過抗氧化酶系統(tǒng)阻止線粒體的變性。有研究表明[49]抗氧化系統(tǒng)的減弱也是導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷的原因之一。Lane[50]發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致 ROS 上升的線粒體代謝的增加伴隨著線粒體的抗氧化劑 SOD2 及 HIF-2α 表達和活性的顯著減少。SOD2 和 HIF-2α 在 OA 期開始時后急性炎癥上調(diào)，隨后在疾病進展下調(diào)[51-54]。

綜上所述，OA 的發(fā)病和進展中，抗氧自由基系統(tǒng)的失活或氧自由基本身的高水平導(dǎo)致的氧自由基失衡所形成的微環(huán)境通過多種環(huán)節(jié)作用于細(xì)胞和組織。目前發(fā)現(xiàn)的氧自由基對 OA 的直接損傷作用會加重炎癥反應(yīng)，影響細(xì)胞因子和膠原蛋白的產(chǎn)生、影響免疫調(diào)節(jié)等導(dǎo)致 OA 損傷。這一穩(wěn)態(tài)也叫作微環(huán)境或致病穩(wěn)態(tài)微環(huán)境。其持續(xù)的表達致病因子和損傷變化，組織修復(fù)缺失和異常都是導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎慢性遷延不愈的基礎(chǔ)。其次氧化應(yīng)激伴隨或?qū)е碌腛A 自我修復(fù)失常及在遺傳物質(zhì)調(diào)控和表達上的改變可能是 OA 的分子水平基礎(chǔ)。而對這些基礎(chǔ)微環(huán)境的研究都將為預(yù)防控制 OA 和治療 OA 開辟新的方向。

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( 本文編輯：李貴存 )

Effects of microenvironment imbalance of oxygen free radicals on the progress of osteoarthritis

LI Hong-bo, PENG Lei.
Department of Orthopedics, the Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou, Hainan, 570102, PRC

Osteoarthritis ( OA ) mainly manifests as articular cartilage degeneration, secondary osteoarthritis and chronic degenerative diseases involving the joint synovium, joint capsule and other adjoining structures of the joint.Its incidence and progress are more complex.In recent years, with the development of molecular biology, pathology and imaging, the understanding of OA has been deepening.Some factors such as biological stress, hormone metabolism, metal atoms, free radical imbalance and certain cytokines are also gradually considered to be closely related with OA.The imbalance of oxygen free radicals in microenvironment caused by dysfunction of mitochondria is considered to be one of the main causes for the development of OA.The imbalance of oxygen free radicals may aggravate mitochondrial damage under the low expression of antioxidant free radicals, making the microenvironment of oxygen free radicals beyond the self-regulated steady state.It is manifested as inflammatory mediator damage, genetic material damage, weakened repair, disorder of apoptosis and autophagy in the structure and time and weakened role of antioxidant free radical system under the microenvironment imbalance of oxygen free radicals.The series of changes based on microenvironment imbalances will continue through the online response to continuously express the damage effect, which is an important reason for chronic and persistent unhealing of OA.In this paper, under the microenvironment imbalance of oxygen free radicals, the effects of oxygen free radical imbalance on the occurrence and progress of OA are briefly reviewed.

Oxygen radicals; Free radicals; Osteoarthritis; Arthritis; Joint diseases

10.3969/j.issn.2095-252X.2016.12.013

R684.3

國家自然科基金 ( 81460339 )

570102 ?？冢Ｄ厢t(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科 ( 李紅波、彭磊 )；571199 ?？?，海南醫(yī)學(xué)院研究生院 ( 李紅波 )

彭磊，Email: xiaobo197518@163.com

2016-04-15 )