李慧敏　綜述，　傅啟華，　王　靜　審校

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，上海 200127)

膠體金在臨床檢驗(yàn)診斷中的研究進(jìn)展

李慧敏綜述，傅啟華，王靜審校

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，上海 200127)

摘要：膠體金是一種廣泛應(yīng)用于納米診斷的納米材料，具有較大的比表面積，獨(dú)特的物理特征，良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性。對(duì)膠體金進(jìn)行特定的修飾可賦予其新的功能。本文主要對(duì)其在臨床檢驗(yàn)診斷中的研究進(jìn)展作一綜述。

關(guān)鍵詞：膠體金；實(shí)驗(yàn)診斷；納米材料

中圖分類(lèi)號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)01-0076-04R446.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.019

Abstract:Gold nanoparticle is a type of nanomaterials, which is widely used in nanodiagnosis, and exhibits high surface-to-volume ratio, unique physical properties, excellent biocompatibility and chemical stability. Gold nanoparticle may easily be functionalized by modification with special molecules. In this review, we mainly focus on the recent advances of gold nanoparticle research in clinical laboratory diagnosis.

基金項(xiàng)目：上海交通大學(xué)“醫(yī)工交叉基金”重點(diǎn)項(xiàng)目(YG2012ZD03)

作者簡(jiǎn)介：李慧敏，女，1988年生，碩士，主要從事分子診斷研究。

通訊作者：王靜，聯(lián)系電話：021-38625569。

收稿日期：(2014-02-20)

The research progress of gold nanoparticle in clinical laboratory diagnosisLIHuimin,FUQihua,WANGJing.(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiChildren′sMedicalCenter,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Key words: Gold nanoparticle; Laboratory diagnosis; Nanomaterial

膠體金(gold nanoparticle)又稱(chēng)為膠體納米金，具有較大的比表面積，獨(dú)特的光學(xué)、導(dǎo)電、導(dǎo)熱等物理特征以及良好的生物相容性。獨(dú)特的依賴(lài)其直徑大小的光學(xué)特征以及在生物流體中的惰性和穩(wěn)定性使膠體金逐漸成為納米診斷中最穩(wěn)定的材料[1]。通過(guò)選擇合適的合成方法即可調(diào)節(jié)由其大小和形狀決定的理化特性。通過(guò)在膠體金上連接巰基化DNA或蛋白質(zhì)可賦予膠體金新的功能。膠體金所擁有的各種特性使其得以與不同的實(shí)驗(yàn)方法相結(jié)合，進(jìn)而廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)診斷。本文對(duì)其在3個(gè)方面的研究進(jìn)展作一綜述。

一、膠體金在免疫層析試紙條(immunochromatographic strip,ICS)法中的應(yīng)用

膠體金在水溶液中溶解呈紅色膠體狀，在診斷實(shí)驗(yàn)中膠體金聚集紅色更加明顯，且這種紅色肉眼即可鑒別。膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)正是基于膠體金的上述特性，將其作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體檢測(cè)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，是繼酶免疫標(biāo)記、熒光免疫標(biāo)記、同位素免疫標(biāo)記三大標(biāo)記技術(shù)之后迅速發(fā)展起來(lái)的新型免疫技術(shù)。其標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，且檢測(cè)不依賴(lài)昂貴的激光檢測(cè)儀器，只需要普通光學(xué)儀器，甚至肉眼即可鑒別。膠體金ICS法生物傳感器正是運(yùn)用了膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)而產(chǎn)生的[1-2]。膠體金與ICS的結(jié)合取得了很大的成就并且已成功應(yīng)用于臨床檢測(cè)。通過(guò)與科研所需要的特定抗體或商業(yè)化途徑購(gòu)買(mǎi)的試劑相結(jié)合，可以適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)需求。一次性的測(cè)試條方便攜帶，所需費(fèi)用低，能快速診斷來(lái)源于臨床、環(huán)境、食物等樣本中的生物分子，并取得可靠的檢測(cè)結(jié)果。

傳統(tǒng)的ICS包括樣本墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜及吸收墊。金標(biāo)墊上涂覆有抗體-膠體金結(jié)合物，可結(jié)合樣本中的靶抗原，組成抗原-抗體-膠體金復(fù)合物。這種復(fù)合物移動(dòng)到硝酸纖維素膜上后被針對(duì)靶抗原的二抗捕獲，導(dǎo)致指示線出現(xiàn)紅色，而檢測(cè)區(qū)的另一條線上涂覆有抗IgG抗體，陰性和陽(yáng)性的樣本在此處均出現(xiàn)紅色而作為對(duì)照線。近年來(lái)，該技術(shù)已進(jìn)行了多種改進(jìn)，如CHING等[3]對(duì)ICS設(shè)計(jì)了雙檢測(cè)線用于肉毒梭菌神經(jīng)毒素(botulinum neurotoxin, BoNT)的檢測(cè)。BoNT具有強(qiáng)大的神經(jīng)毒性，通過(guò)抑制乙酰膽堿的釋放導(dǎo)致中毒者癱瘓甚至死亡。其共有7個(gè)血清型，即BoNT/A~G，80%的中毒反應(yīng)由包括BoNT/A和BoNT/B在內(nèi)的4個(gè)血清型所導(dǎo)致[4]。在檢測(cè)區(qū)分別涂覆抗BoNT/A單克隆抗體-膠體金復(fù)合物和抗BoNT/B單克隆抗體-膠體金復(fù)合物，可以分別并同時(shí)檢測(cè)最低5 ng/mL的BoNT/A和10 ng/mL的BoNT/B。改進(jìn)后的方法操作簡(jiǎn)便，敏感性高，不需要特定的儀器和實(shí)驗(yàn)操作人員，且能同時(shí)分辨2種血清型的神經(jīng)毒素。

二、膠體金在比色法中的應(yīng)用

一般情況下，膠體金(15 nm)溶解時(shí)成紅色膠體狀，在520 nm出現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)，而聚集時(shí)呈現(xiàn)藍(lán)紫色，且最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生偏移。通過(guò)吸附核酸序列、抗體等分子，膠體金得以與比色分析法結(jié)合，為臨床診斷提供快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。膠體金擁有較大的比表面積，能夠提高蛋白質(zhì)、核酸或其它生物分子的固載量，使電流信號(hào)響應(yīng)增強(qiáng)，提高傳感器的敏感性。在過(guò)去的幾十年中，以膠體金為基礎(chǔ)的生物傳感器被成功地應(yīng)用于核酸[5]、蛋白質(zhì)[6]、凝血因子[7]和病毒核酸序列的檢測(cè)(如丙型肝炎病毒核酸序列的檢測(cè)[8])，且這些生物傳感器均具有較高的敏感性、特異性以及費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。因此越來(lái)越多的科研人員開(kāi)始關(guān)注于其作為生物傳感器在分子識(shí)別和核酸檢測(cè)方面的應(yīng)用。單鏈DNA對(duì)帶負(fù)電荷的膠體金有很好的親和力，其與膠體金的結(jié)合可以抵抗鹽溶液對(duì)膠體金的聚集作用。膠體金對(duì)單鏈DNA的吸附作用取決于單鏈DNA的長(zhǎng)度和反應(yīng)溫度，較短的單鏈DNA和較高的反應(yīng)溫度促進(jìn)膠體金對(duì)單鏈DNA的吸附[9]。由于單鏈DNA具有易于折疊和解螺旋的特性，其暴露的堿基很容易通過(guò)范德華力吸附在膠體金上。其堿基上的氮原子可以將自身的負(fù)電荷傳遞給膠體金，增加膠體金所攜帶的負(fù)電荷和其之間的電荷排斥力，抑制其在鹽溶液中的聚集。DENG等[10]以炭疽桿菌核酸序列為模板，設(shè)計(jì)合適的引物，通過(guò)不對(duì)稱(chēng)聚合酶鏈反應(yīng)(asymmetric polymerase chain reaction, As-PCR)，擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的單鏈DNA(116nt、242nt、345nt、508nt)，將這些長(zhǎng)度不同的單鏈DNA分別包被膠體金，結(jié)果表明這些單鏈DNA與膠體金結(jié)合后均能抵抗鹽溶液對(duì)膠體金的聚集作用，使膠體金呈現(xiàn)紅色。該文獻(xiàn)第1次報(bào)道了長(zhǎng)片段DNA與膠體金的結(jié)合，且這些不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物包括了我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)中常用到的片段長(zhǎng)度，說(shuō)明這種方法也同時(shí)可用于其他病原體的檢測(cè)。

越來(lái)越多的科研人員根據(jù)膠體金的上述特性發(fā)展了不同的檢測(cè)方法。GILL等[11]通過(guò)依賴(lài)解旋酶的恒溫?cái)U(kuò)增(thermophilic helicase-dependent isothermal amplification，tHDA)對(duì)幽門(mén)螺桿菌的ureC基因進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)分別與擴(kuò)增產(chǎn)物兩端互補(bǔ)的探針，將探針與膠體金結(jié)合并溶解在鹽溶液中，此時(shí)該溶液呈現(xiàn)紅色，且在520 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入到上述溶液中，因探針與 PCR擴(kuò)增所獲得的核酸序列兩端互補(bǔ)而結(jié)合在該序列兩端，克服膠體金之間的相互排斥作用，使膠體金發(fā)生聚集，膠體金溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)紫色，且通過(guò)比色法分析發(fā)現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生偏移。該方法具有一定的敏感性(可檢測(cè)最低10 CFU/mL的幽門(mén)螺桿菌)，適用于檢測(cè)核酸序列較長(zhǎng)的基因。精液中果糖的含量反映精囊的功能，濃度過(guò)低可導(dǎo)致不育癥。RAJ等[12]將3-氨基苯硼酸和L-谷氨酸-三氯酯修飾在膠體金表面，待測(cè)樣本中的果糖可以與上述2種物質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致膠體金聚集，該方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果肉眼即可判斷，為臨床患者提供了極大的方便。透明質(zhì)酸酶被看作是膀胱癌在尿液中的腫瘤標(biāo)志物，NOSSIER等[13]將帶有多聚陰離子的透明質(zhì)酸和經(jīng)處理后帶有正電荷的膠體金混合孵育，正負(fù)電荷之間的相互吸引導(dǎo)致膠體金的聚集，待檢樣本中含有的透明質(zhì)酸酶可以把透明質(zhì)酸降解為小的片段，阻止透明質(zhì)酸對(duì)膠體金的吸附聚集作用。通過(guò)該方法可以定量檢測(cè)尿液中透明質(zhì)酸酶的活性，為疑似膀胱癌患者提供有效的無(wú)創(chuàng)性檢測(cè)。

通過(guò)上述這些科研人員的嘗試，我們可以發(fā)現(xiàn)，膠體金應(yīng)用于臨床檢測(cè)已不再局限于通過(guò)與核酸、蛋白的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)，膠體金本身的特性決定了其廣泛的應(yīng)用范圍?？梢愿鶕?jù)不同的檢測(cè)需求，靈活設(shè)計(jì)出不同的實(shí)驗(yàn)方案。

三、膠體金在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescent resonance energy transfer,FRET)及分子信標(biāo)中的應(yīng)用

FRET是基于熒光基團(tuán)供體和熒光基團(tuán)受體間偶極子-偶極子耦合作用的非輻射方式的能量傳遞現(xiàn)象。FRET生物傳感器廣泛應(yīng)用于各種生物分子的檢測(cè)，如檢測(cè)蛋白酶活力[14]等。因AuNPs具有高效淬滅活性和穩(wěn)定的光學(xué)特性而被廣泛應(yīng)用于FRET。具有生物相容性的膠體金可以通過(guò)一個(gè)通用平臺(tái)，為以超敏熒光為基礎(chǔ)的探針提供較高的淬滅活性且具有被靶分子特異性識(shí)別的特性[15]。具有代表性的是其在分子信標(biāo)中的應(yīng)用，見(jiàn)圖1。分子信標(biāo)是一種在5′和3′末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的AuNPs緊緊靠近，熒光基團(tuán)(供體)受激發(fā)后產(chǎn)生的光子被AuNPs(受體)淬滅，因而不會(huì)產(chǎn)生熒光[16]。

注：A為用于檢測(cè)目的片段的分子信標(biāo)，其中黑色的環(huán)狀單鏈DNA和目的片段互補(bǔ),紅色單鏈DNA分別連接熒光集團(tuán)和作為淬滅集團(tuán)的AuNPs;B為目的片段;C為分子信標(biāo)和目的片段結(jié)合，熒光集團(tuán)和AuNPs分離，淬滅作用解除，發(fā)出熒光

圖1分子信標(biāo)檢測(cè)目的核酸片段

近年來(lái)，隨著納米材料的廣泛使用，該技術(shù)也在原有的基礎(chǔ)上獲得了改進(jìn)，使其更好地服務(wù)于臨床診斷和科學(xué)研究。如SONG等[17]將15 nm的膠體金作為受體，膠體金直徑的擴(kuò)大使其表面可以同時(shí)交聯(lián)3種不同的特異寡核苷酸探針以識(shí)別特定核酸序列(定性)，且3種不同的特異寡核苷酸探針?lè)謩e被3種不同顏色的熒光染料標(biāo)記(定量)，這樣膠體金上的熒光光譜就能夠顯示樣本中目標(biāo)序列的有無(wú)和多少，進(jìn)而可以檢測(cè)到3種不同的生物分子，如腫瘤標(biāo)志物。該方法的實(shí)現(xiàn)得益于膠體金較高的、基本上能淬滅所有熒光染料的淬滅活性，而不必去考慮優(yōu)化膠體金和不同的熒光染料配對(duì)時(shí)的條件。同時(shí)，由于探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)存在構(gòu)象限制，使該方法即使對(duì)單一錯(cuò)配的序列也有著較高的序列特異性。

膠體金-蛋白質(zhì)納米探針也被廣泛應(yīng)用于FRET，膠體金和蛋白質(zhì)之間的連接主要依靠暴露在蛋白質(zhì)表面的-SH[18]和-NH2集團(tuán)對(duì)膠體金的吸附、固定作用，以及蛋白質(zhì)和膠體金之間的物理吸附作用[19]。通過(guò)膠體金和蛋白質(zhì)的結(jié)合，DENG等[20]設(shè)計(jì)出一段可以被絲氨酸蛋白酶水解的肽鏈來(lái)連接分子信標(biāo)中的供體和受體。絲氨酸蛋白酶是一種Ⅱ型跨膜蛋白，高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面，對(duì)腫瘤細(xì)胞的早期增殖發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。待測(cè)樣本中的絲氨酸蛋白酶通過(guò)水解肽鏈，使熒光基團(tuán)與膠體金分離，淬滅作用被解除，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光。這些對(duì)分子信標(biāo)技術(shù)的改善說(shuō)明了膠體金和分子信標(biāo)技術(shù)的結(jié)合在臨床檢驗(yàn)診斷方面有著很大的發(fā)展空間。

四、展望

膠體金擁有廣泛的表面功能和生物結(jié)合能力以及獨(dú)特的物理特性，使其成功地應(yīng)用于物理和化學(xué)多種領(lǐng)域。膠體金較高的比表面積，在多重檢測(cè)中所展現(xiàn)的高度敏感性和特異性，使其成為非常具有應(yīng)用前景的納米材料?？烧{(diào)整的合成方法和幾乎沒(méi)有限制的理化功能基團(tuán)，使其成為醫(yī)學(xué)診斷和治療中最熱門(mén)的納米材料[21]。膠體金ICS是一種成功的應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)診斷的技術(shù)，特別適合于廣大基層醫(yī)院進(jìn)行大批量、時(shí)間緊的檢測(cè)和大面積普查等。

然而，膠體金本身的性質(zhì)包括其表面特性及直徑大小對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，標(biāo)記到膠體金表面的各種生物分子探針的穩(wěn)定性、活性、特異性以及某些實(shí)驗(yàn)中需要用到的高分辨率檢測(cè)儀器卻在一定程度上限制了膠體金在臨床檢驗(yàn)診斷中的推廣和應(yīng)用。因此，需要更多研究人員的共同努力，在膠體金的表面修飾、生物分子標(biāo)記及生化反應(yīng)條件、相應(yīng)的檢測(cè)儀器等方面進(jìn)一步改進(jìn)，使膠體金真正應(yīng)用到臨床檢測(cè)。

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(本文編輯：姜敏)