韓　偉，滿　寧

(華東理工大學(xué) 藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代化工程中心，上?！?00237)

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HD-8陽離子交換樹脂純化灰樹花多糖及其抗氧化活性的研究

韓偉，滿寧

(華東理工大學(xué) 藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237)

摘要：以脫蛋白率、脫色率和多糖保留率為指標(biāo)，篩選出灰樹花多糖純化效果較佳的陽離子交換樹脂HD-8，并對(duì)其純化工藝進(jìn)行考察，獲得優(yōu)化的工藝條件為：流速2 BV/h(1 mL/min)、上樣量400 mL(蛋白質(zhì)含量為99.2 mg)、上樣的量做濃度0.248 mg/mL(多糖提取液中蛋白質(zhì)濃度)，多糖純度達(dá)62.66%.與其他工藝相比，采用HD-8樹脂能有效地提高灰樹花多糖的純度且節(jié)約成本、操作高效；同時(shí)對(duì)灰樹花多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià).

關(guān)鍵詞：灰樹花；多糖；樹脂；抗氧化

灰樹花(Grifolafrondosa)，又稱舞茸、蓮花菇、栗子蘑等，屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，多孔菌科[1]，從溫帶到亞熱帶森林均有分布，在我國(guó)和日本被廣泛栽培，是一種好氧喜光的大型木腐真菌.灰樹花形態(tài)如蓮花似珊瑚，肉質(zhì)脆嫩，雞絲香味[2]，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和多種藥理療效，是近年來熱點(diǎn)研究開發(fā)的珍奇真菌之一.灰樹花的主要生物活性成分有多糖、多酚、核酸、蛋白質(zhì)、脂類等[3]，還富含多種氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和有機(jī)酸，膳食纖維高達(dá)33.7%[4].其中灰樹花多糖具有抗腫瘤，抗HIV病毒，增強(qiáng)免疫功能，調(diào)節(jié)血壓、血糖和血脂等生物功能[5]，在醫(yī)療和保健方面具有很高的開發(fā)利用價(jià)值及良好的應(yīng)用前景.

多糖的脫蛋白純化方法一般有Sevage法、醇沉法、三氯乙酸法等[6].這些純化方法存在有機(jī)試劑用量大、操作時(shí)間長(zhǎng)、效果差等缺點(diǎn).本文以灰樹花子實(shí)體為研究體系，脫蛋白率、脫色率、多糖保留率為指標(biāo)，采用動(dòng)態(tài)法篩選出純化效果較佳的HD-8陽離子交換樹脂，并對(duì)其操作工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化；最后選用羥自由基法[7-8]對(duì)純化后的灰樹花多糖進(jìn)行體外抗氧化活性評(píng)價(jià).

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)原料與試劑

灰樹花，真菌干品，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院；葡萄糖(標(biāo)準(zhǔn)品>95%)，硫酸，苯酚，醋酸，抗壞血酸(VC)，過硫酸鉀(KS2O4)，過氧化氫(H2O2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%)，水楊酸，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O) 和無水乙醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白(標(biāo)準(zhǔn)品>98%)，BR，上海源聚生物科技有限公司；殼聚糖，分析純，上海偉康生物制品有限公司.

樹脂：大孔吸附樹脂HZ803、HZ806、HZ816、HZ820，大孔型離子交換樹脂D202、D301、D001、DK110、HD-8，凝膠型離子交換樹脂711(201×4)、335、732，選購于上海華震科技有限公司.

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

紫外-可見分光光度計(jì)(UV1900PC，上海亞研電子科技有限公司)，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S，鞏義市英峪予華儀器廠)，循環(huán)水真空泵(SHB-Ⅲ型，鞏義市英峪予華儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52C，上海予華儀器有限公司)，微波爐(ER-692型，中國(guó)電子器件工業(yè)總公司)，電子天平(AL104，梅特勒托利多)，超聲波清洗器(SK3310HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(RJ-TGL-16C，無錫市瑞江分機(jī)儀器有限公司).

1.3分析方法

1.3.1多糖質(zhì)量的測(cè)定方法

最大吸收波長(zhǎng)的確定：采用苯酚-硫酸法[9]進(jìn)行顯色反應(yīng)，在400～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描.根據(jù)掃描結(jié)果，確定489 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng).

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別量取0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于25 mL具塞比色管中，補(bǔ)水至2 mL，按上述的苯酚-硫酸顯色法于489 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：A=0.004 37+15.978 57C，R=0.999 67.利用該回歸方程計(jì)算灰樹花多糖樣品溶液中多糖的含量M=n×C×V，式中：C為樣品中多糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)，V為溶劑量(mL)，n為溶液稀釋倍數(shù).

1.3.2蛋白質(zhì)質(zhì)量的測(cè)定方法

試劑的配制：精確稱取20 mg牛血清蛋白，去離子水溶解，定容至100 mL容量瓶，即得0.20 mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；精確稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶解于50 mL 95%乙醇，再加入100 mL 85%磷酸，去離子水定容至1000 mL，靜置一段時(shí)間，過濾，濾去不溶物即得.

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[10]，分別精密量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL具塞比色管中，補(bǔ)水至1.0 mL，分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻，靜置5 min，于595 nm[11]波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：A=4.800 76C+0.029 08，R=0.999 01.利用方程計(jì)算得到蛋白質(zhì)質(zhì)量N=C×V×100%(mg)，式中：C為溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，V為溶液體積(mL).

1.3.3多糖保留率、脫蛋白率、脫色率、多糖純度及自由基清除率的計(jì)算公式：

式中：M1為過柱前多糖質(zhì)量 (mg)，M2為過柱后多糖質(zhì)量 (mg).

式中：N1為過柱前蛋白質(zhì)質(zhì)量 (mg)，N2為過柱后蛋白質(zhì)質(zhì)量 (mg).

式中：A1為過柱前溶液的吸光度值，A2為過柱后溶液的吸光度值.

式中：C0為灰樹花多糖溶液中多糖的濃度(mg/mL)，V0為灰樹花多糖溶液體積(mL)，M為溶液濃縮后的干膏質(zhì)量 (mg).

式中：K為樣品溶液對(duì)自由基的清除率，A0為去離子水代替樣品溶液反應(yīng)的吸光度，A1為樣品溶液清除自由基反應(yīng)液的吸光度，A2為去離子水代替H2O2溶液反應(yīng)的吸光度.

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1灰樹花多糖的樹脂純化

1)將灰樹花粉碎，選用粒徑范圍10～20目，液固比20 mL/g，在pH為4.71左右的去離子水中微波提取240 s(輸出功率為650 W，微波頻率為2450 MHz).提取液冷卻至室溫后，進(jìn)行稱重補(bǔ)水，再抽濾，即制備得灰樹花多糖提取液.

2)樹脂的預(yù)處理

大孔吸附樹脂：首先用去離子水反復(fù)浸洗樹脂，直至浸洗液無泡沫；再將其用95%乙醇浸泡24 h，之后用去離子水沖洗至無乙醇?xì)馕?，然后用去離子水浸泡備用.

陽(陰)離子交換樹脂：將樹脂用去離子水反復(fù)浸洗，直至浸洗水澄清無褐色為止；再用1 mol/L 的NaOH溶液(1 mol/L鹽酸溶液) 浸泡，量為樹脂體積的4倍，24 h后用去離子水沖洗，直至浸泡水pH值為6～7；然后用1 mol/L鹽酸溶液(1 mol/L 的NaOH溶液)浸泡，量為樹脂體積的4倍，浸泡24 h后，用去離子水浸洗至pH值為7左右，即可投入使用.

3)裝柱：將預(yù)處理過的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，在層析柱內(nèi)(1.5 cm×50 cm)注入一定量去離子水，趕走空氣；再準(zhǔn)確稱取20 g樹脂，加入去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內(nèi)，使其自由沉降；沉降結(jié)束形成樹脂床層后，靜置過夜，備用.

4)樹脂柱活化：實(shí)驗(yàn)前，將100 mL左右的去離子水以適宜的流速流過樹脂柱，重復(fù)操作3遍，即可上樣使用.

5)上樣：取適量灰樹花多糖提取液，以一定的流速流過活化后的樹脂柱，收集流出液，即為純化后的灰樹花多糖提純液.流速考察范圍取1～5 BV/h；上樣量取200、250、300、350、400、450、500 mL；上樣濃度分別取上樣液體積的0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50倍.

6)按“1.3”項(xiàng)的分析方法計(jì)算脫蛋白率、脫色率、多糖保留率及純度.

1.4.2灰樹花多糖的絮凝純化和醇沉工藝

研究中還考察了絮凝和醇沉工藝純化灰樹花多糖的效果，方法如下：

1)絮凝純化法

精密量取一定量的灰樹花多糖提取液，按1.0 mL/g (絮凝劑體積/藥材質(zhì)量) 加入絮凝劑(1%殼聚糖乙醇試劑)，液藥比40 mL/g，藥液pH為6，溫度控制在45 ℃；磁力攪拌1 h，離心15 min(5000 r/min)，取上層澄清液，即為絮凝純化后的灰樹花多糖溶液.將純化后多糖溶液濃縮至膏狀，烘干稱重，測(cè)定多糖和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算多糖保留率、脫蛋白率和純度.

2)醇沉工藝

精密量取多糖提取液和無水乙醇，混合使乙醇體積分?jǐn)?shù)保持在80%左右，靜置24 h，離心，沉淀用無水乙醇、丙酮分別洗滌3次，80 ℃干燥12 h，稱重.測(cè)定計(jì)算多糖保留率、脫蛋白率和純度.

1.4.3灰樹花多糖的抗氧化活性研究

1)反應(yīng)試劑的制備

①灰樹花多糖溶液：按照“1.4.1”項(xiàng)(1)中方法提取灰樹花多糖，再采用本文優(yōu)化的HD-8陽離子交換樹脂純化工藝制備灰樹花多糖(PGF1)，按“1.4.2”項(xiàng)中的殼聚糖絮凝純化法制備灰樹花多糖(PGF2).

②精密配備10 mg/mL的VC試劑(實(shí)驗(yàn)中稀釋至不同濃度使用)，2 mmol/L FeSO4溶液，6 mmol/L H2O2溶液，6 mmol/L水楊酸溶液.

2)羥基自由基法

精密量取1 mL灰樹花多糖溶液，置于具塞比色管中，加入1 mL FeSO4溶液，再加入1mL H2O2溶液，搖勻，靜置15 min，然后加入1 mL水楊酸溶液，搖勻并開始記時(shí)，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，從第2 min開始，每隔1 min記錄1次，直至吸光度讀數(shù)趨于穩(wěn)定.按公式計(jì)算清除率，選用VC作為陽性對(duì)照組，VC試劑對(duì)OH·的清除反應(yīng)操作同上.

根據(jù)樣品溶液對(duì)OH·清除率隨時(shí)間變化的結(jié)果，確定VC、PGF1和PGF2組分別靜置反應(yīng)的時(shí)間.進(jìn)而考察不同濃度的樣品溶液對(duì)羥基自由基的清除率.

2結(jié)果與分析

2.1樹脂篩選

按“1.4.1”項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)各類型樹脂的動(dòng)態(tài)吸附純化效果進(jìn)行考察，以脫蛋白率、脫色率及多糖保留率為指標(biāo)，綜合考慮樹脂吸附雜質(zhì) (蛋白質(zhì)、色素) 的能力及多糖的損失情況，結(jié)果見表1.

表1可以看出：在相同的動(dòng)態(tài)吸附除雜條件下，不同種類、極性、酸堿性、粒徑和含水量的樹脂對(duì)蛋白質(zhì)、色素、多糖的吸附能力不同，即對(duì)多糖中蛋白質(zhì)和色素的脫除及多糖保留效果有差別.大孔型陽離子交換樹脂HD-8、D001、凝膠型陽離子交換樹脂732的脫蛋白率和多糖保留率均在90%以上，脫色率也較高，多糖純度均達(dá)60%.其中陽離子交換樹脂HD-8純化效果最佳，多糖純度為61.78%.因此，本文選擇陽離子交換樹脂HD-8脫除灰樹花多糖中的雜質(zhì)，同時(shí)對(duì)其純化工藝做進(jìn)一步研究.

表1　動(dòng)態(tài)篩選結(jié)果

2.2HD-8型陽離子交換樹脂的純化工藝

2.2.1流速的考察

通常情況下，當(dāng)流出液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為上樣液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的10%時(shí)，認(rèn)為樹脂吸附蛋白質(zhì)飽和，即樹脂脫除多糖溶液中的雜質(zhì)蛋白達(dá)終點(diǎn).此時(shí)，將收集的流出液體積稱之為泄漏點(diǎn)[12-13].本實(shí)驗(yàn)以脫蛋白效果為指標(biāo)，考察HD-8陽離子交換樹脂純化工藝的適宜流速.

從圖1可以看出，流速為1 BV/h時(shí)，流出液中蛋白質(zhì)濃度增加最為緩慢，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)最遲，隨著流速增大，泄漏點(diǎn)開始提前，脫蛋白效果變差.這是因?yàn)榱魉偌涌欤芤褐械鞍踪|(zhì)與樹脂接觸不充分，導(dǎo)致樹脂不能有效吸附雜質(zhì)蛋白，故流出液中蛋白質(zhì)濃度增加，樹脂脫蛋白效果變差.因此，應(yīng)該選擇較慢的流速，有利于樹脂充分吸附雜質(zhì)蛋白.由于1 BV/h流速在處理相同體積上樣液的時(shí)間是2 BV/h流速的兩倍，綜合考慮工藝的便捷、效率、成本及純化效果，選取動(dòng)態(tài)純化過柱流速為2 BV/h.

2.2.2上樣量的考察

從圖2可以看出，在流速和上樣濃度相同的條件下，HD-8陽離子交換樹脂對(duì)多糖溶液的脫蛋白率隨著上樣量的增加先緩慢降低，上樣量超過400 mL時(shí)，脫蛋白率顯著下降；多糖保留率隨上樣量的增加不斷增大；這主要是因?yàn)殡S著上樣量的增加，樹脂不斷吸附上樣液中的雜質(zhì)蛋白，從400 mL左右開始，對(duì)蛋白質(zhì)的吸附量逐漸趨于飽和，繼續(xù)增加上樣量，則脫蛋白率顯著下降，脫蛋白效果變差.同時(shí)，樹脂對(duì)多糖亦具有一定的吸附作用，不斷增加上樣量，吸附效果逐漸達(dá)飽和，對(duì)多糖的吸附率不斷下降，故流出液中多糖保留率不斷增大.綜合考慮脫蛋白率和多糖保留率對(duì)純化效果的影響，選擇上樣量為400 mL，經(jīng)測(cè)定，其中蛋白質(zhì)質(zhì)量為99.2 mg.

圖1　不同流速對(duì)樹脂HD-8脫蛋白效果的影響

圖2　不同上樣量對(duì)樹脂HD-8純化效果的影響

2.2.3上樣質(zhì)量濃度的考察

由圖3可知，當(dāng)流速與上樣量相同時(shí)，隨著上樣液體積倍數(shù)增大，即上樣質(zhì)量濃度減小，脫蛋白率增大，多糖保留率逐漸下降.這是因?yàn)樯蠘右嘿|(zhì)量濃度較小時(shí)，單位體積內(nèi)的蛋白質(zhì)含量較低，與樹脂表面接觸更充分，有利于樹脂對(duì)蛋白質(zhì)的吸附，脫蛋白率較大；同理，上樣液質(zhì)量濃度較小時(shí)，樹脂對(duì)多糖的吸附也更充分，則多糖保留率較低.由于從1.00倍開始，脫蛋白率上升緩慢，而多糖保留率下降較明顯，故選取1.00倍，經(jīng)測(cè)定，該多糖溶液中蛋白質(zhì)的濃度為0.248 mg/mL，即最佳上樣濃度為0.248 mg/mL左右.

通過對(duì)以上三個(gè)因素的考察，獲得HD-8型陽離子交換樹脂動(dòng)態(tài)脫蛋白純化灰樹花多糖的優(yōu)化工藝為：流速2 BV/h(1 mL/min)、上樣量400 mL(蛋白質(zhì)含量99.2 mg)、上樣質(zhì)量濃度為0.248 mg/mL(多糖提取液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度)，多糖純度達(dá)62.66%.

2.3不同純化工藝的比較

將HD-8型陽離子交換樹脂純化法、殼聚糖絮凝純化法、傳統(tǒng)醇沉法的純化結(jié)果進(jìn)行比較，見表2.

表2　不同純化工藝的比較

從表2可知，與傳統(tǒng)的醇沉法、殼聚糖純化法相比，HD-8陽離子交換樹脂純化效果最好，脫蛋白率和多糖保留率均大大提高，多糖純度達(dá)62.66%，比醇沉法和殼聚糖絮凝法分別提高了36.75%、8.88%；且操作時(shí)間較醇沉法大大縮減.由此表明，HD-8陽離子交換樹脂純化工藝是一種高效省時(shí)的純化方法.

2.4灰樹花多糖的體外抗氧化活性研究

本文選用羥自由基法評(píng)價(jià)灰樹花多糖的抗氧化活性，灰樹花多糖清除OH·的研究結(jié)果如圖4.

從圖4可以看出，PGF和VC清除羥基自由基的反應(yīng)在20 min左右，清除率均變化極為平緩，趨于平衡，故本研究中灰樹花多糖溶液與VC清除羥基自由基的反應(yīng)時(shí)間均選為30 min.

圖3　不同上樣質(zhì)量濃度對(duì)樹脂HD-8純化效果的影響

圖4　羥自由基清除率隨時(shí)間變化曲線

圖5　VC、PGF1和PGF2對(duì)羥自由基清除率的量效曲線

圖5為VC、PGF1和PGF2對(duì)羥自由基清除率的量效曲線圖.結(jié)果表明，陽離子交換樹脂HD-8純化與殼聚糖絮凝純化制備的灰樹花多糖對(duì)羥基自由基的清除活力存在一定的差異，同時(shí)清除率均較高，具有抗氧化作用效果.從圖中可以看到，陽性對(duì)照組VC的質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，清除率KVC達(dá)最大，為99.81%；在0.5～2 mg/mL濃度范圍，PGF2對(duì)羥基自由基的清除率KPGF2大于PGF1對(duì)羥基自由基的清除率KPGF1，濃度為2～6 mg/mL時(shí)，KPGF1大于KPGF2；5 mg/mL時(shí)KPGF2為44.66%，KPGF1為48.28%，6 mg/mL時(shí)，KPGF1可達(dá)55.11%，兩者仍隨濃度的增加呈不斷增大的趨勢(shì).

3結(jié)語

1)以灰樹花子實(shí)體多糖為研究對(duì)象，對(duì)12種不同類型樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)純化研究，篩選出效果最好的HD-8陽離子交換樹脂，多糖純度達(dá)61.78%.

2)對(duì)HD-8樹脂吸附進(jìn)行工藝優(yōu)化，得到優(yōu)化的條件為：上柱流速2 BV/h，上樣量400 mL，上樣液濃度0.248 mg/mL，純化后多糖純度達(dá)62.66%.HD-8陽離子交換樹脂動(dòng)態(tài)純化工藝與醇沉法、殼聚糖絮凝法相比，純度高、操作時(shí)間短，除雜效果理想，避免了使用有機(jī)溶劑，樹脂可循環(huán)再利用，工藝經(jīng)濟(jì)環(huán)保，適合連續(xù)化工業(yè)生產(chǎn)，具有開發(fā)應(yīng)用價(jià)值.

3)以VC為陽性對(duì)照組，結(jié)果表明，在1～6 mg/mL濃度范圍，PGF1、PGF2對(duì)OH·的清除率存在一定的差異；同時(shí)，PGF1和PGF2對(duì)OH·最大清除率均高達(dá)50%左右，表明灰樹花多糖能有效清除羥基自由基，具有抗氧化方面的應(yīng)用潛力，可以作為一種抗氧化真菌進(jìn)行開發(fā)利用.

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(編輯崔思榮)

Study On the Purification and Antioxidant Activity in Vitro of Polysaccharides in

Fruiting Body ofGrifolaFrondosa(PGF) with Cation Exchange Resin HD-8

HAN Wei, MAN Ning

(Engineering Center for Traditional Chinese Medicine Modernization,

School of pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

Abstract:Using removal rate of protein,decolorization ratio,and retention rate of polysaccharides as indexes, cation exchange resin HD-8 was screened out with good purification effect.Optimal parameters of HD-8 purification process were studied as follows:flow rate was 2 BV/h(1mL/min);sampling amount was 400 mL(protein content was 99.2 mg);sample concentration was 0.248 mg/mL(protein concentration in extracting solution); and the purity of polysaccharides was 62.66%.Compared with other methods,PGF purified by cation exchange resin HD-8 can greatly improve the purity with cost-saving,high efficiency.And the antioxidant activity in vitro of polysaccharides was evaluated as well.

Key words:Grifola frondosa; polysaccharides; resin; antioxidant activity

中圖分類號(hào)：S985.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-358X(2015)04-0018-06

作者簡(jiǎn)介：韓偉(1968-)，男，江蘇寶應(yīng)人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事天然產(chǎn)物的提取、分離及功能研究.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué) (20006003)；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)項(xiàng)目[瀘農(nóng)科攻字(2012)第2—9號(hào)]

收稿日期：2015-05-08