朱英華　 李晶晶　 郭倩囡

端粒酶催化亞基hTERT調(diào)控乳腺癌細(xì)胞自我更新能力的探討

朱英華 李晶晶 郭倩囡

【摘要】目的球囊培養(yǎng)富集乳腺癌干性樣細(xì)胞并檢測(cè)hTERT的表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)RNA干擾的方法探討其對(duì)乳腺癌細(xì)胞自我更新能力的影響。方法 球囊培養(yǎng)富集乳腺癌干性樣細(xì)胞，檢測(cè)乳腺癌干性細(xì)胞與分化細(xì)胞中hTERTmRNA及蛋白的表達(dá)，小分子RNA干擾敲低hTERT的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 乳腺癌干性細(xì)胞中hTERT表達(dá)升高，敲低其表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞自我能力下降。結(jié)論 高表達(dá)的hTERT促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的自我更新能力。

【關(guān)鍵詞】端粒酶催化亞基hTERT；乳腺癌干性細(xì)胞

作者單位： 510120 廣東省廣州市中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：c002015010）

High Expressed hTERT Regulating the Self-renewal Ability of Breast Cancer Stem Cell

ZHU Yinghua LI Jingjing GUO Qiannan, Medical Research Center, Sun Yat-Sen Memorial Hospital Affiliated to Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, China

[Abstract]Objective To investigate the expression of hTERT and the effect of hTERT on the self-renewal ability of breast cancer stem cell. Methods Detecting the expression of hTERT by RT- PCR and Western Blot. Knockdown the expression of hTERT by RNA interference. Results We finded out that hTERT is high expressed in breast cancer stem cell, and reduced the expression of hTERT suppressed the self-renewal ability of breast cancer cell. Conclusion High expressed hTERT enhanced the selfrenewal ability of breast cancer stem cell.

[Key words]hTERT, Breast cancer stem cell

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)已成為威脅女性健康的頭號(hào)殺手，乳腺癌的傳統(tǒng)治療方法包括外科手術(shù)摘除腫瘤、放療、化療、內(nèi)分泌治療等方法。雖然大多數(shù)乳腺癌患者從以上治療中獲益，但仍有不少的乳腺癌病人出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[1]。大量研究證實(shí)了乳腺癌干細(xì)胞的存在，研究表明乳腺癌干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新能力、多向分化潛能以及多藥耐藥和放化療抵抗特性[2-4]。大量文獻(xiàn)已證明端粒酶在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[5-7]。因此，我們推測(cè)乳腺癌干細(xì)胞的存在是乳腺癌治療失敗的主要原因之一，而乳腺癌干細(xì)胞的發(fā)生形成機(jī)制并沒(méi)有研究透徹，本研究重點(diǎn)探討了端粒酶催化亞基hTERT對(duì)乳腺癌干細(xì)胞自我更新能力的影響，為乳腺腫瘤的臨床治療提供新的方向。

[1]薛宏宇. 凋亡通路蛋白表達(dá)對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)PC12多細(xì)胞凋亡的影響[J]. 宿州學(xué)院學(xué)報(bào)，2011（5）：12-35.

[2] 焦鳳有. 左旋多巴聯(lián)合地昔帕明治療帕金森患者抑郁癥狀的效果研究[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2012(11)：8-13.

[3] Jean-Francois Trempe， Edward A. Fon. Structure and function of Parkin， PINK1， and DJ-1， the three musketeers of neuroprotection[J]. Frontiers in neurology，2013(4)：1-11.

[4] 李冬梅，盧幸明，叢志強(qiáng). 多巴胺受體激動(dòng)劑治帕金森病的臨床研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊(cè)，2004(6)：16-20.

1　材料與方法

1.1材料

MCF7細(xì)胞使用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；siRNA由吉瑪公司合成；RT-PCR kit購(gòu)自invitrogen公司；轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自invitrogen公司；hTERT抗體購(gòu)買自ABCAM公司，GAPDH抗體購(gòu)自PTG公司。

1.2球囊培養(yǎng)

將MCF7細(xì)胞胰酶消化成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，然后將細(xì)胞種入球囊培養(yǎng)基中，最終細(xì)胞密度為1 000/毫升，懸浮狀態(tài)下培養(yǎng)兩周收獲球囊。

1.3RNA干擾實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將MCF7細(xì)胞鋪入培養(yǎng)板中，24小時(shí)后細(xì)胞密度達(dá)到50%，按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明將轉(zhuǎn)染試劑和siRNA混合后靜置15分鐘后，將混合物轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，6小時(shí)換新鮮培養(yǎng)基，48小時(shí)后收獲細(xì)胞。

1.4RT-PCR

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，反應(yīng)條件參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，然后于PCR方法檢測(cè)基因表達(dá)并以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量。

2　結(jié)果

2.1hTERT在乳腺癌球囊細(xì)胞中高表達(dá)

將乳腺癌細(xì)胞MCF7貼壁細(xì)胞進(jìn)行懸浮球囊培養(yǎng)后，分別抽提mRNA和蛋白，利用半定量PCR及免疫印跡法檢測(cè)hTERT在貼壁細(xì)胞及球囊細(xì)胞中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳腺癌球囊細(xì)胞中hTERT在mRNA水平（圖1, A）和蛋白水平（圖1, B）均有升高。

2.2降低hTERT的表達(dá)影響了乳腺癌細(xì)胞的球囊形成能力

本研究利用RNA干擾的方法敲低hTERT的表達(dá)進(jìn)而研究其對(duì)球囊形成能力的影響。MCF7細(xì)胞中hTERT的表達(dá)被敲低后（圖2, A），其球囊形成能力明顯下調(diào)（圖2, B），這提示hTERT可能參與調(diào)控了乳腺癌細(xì)胞的球囊形成能力。

圖1　RT-PCR和western 檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中hTERT的表達(dá)情況

圖2　hTERT調(diào)控了乳腺癌細(xì)胞的球囊形成能力

3　討論

端粒酶主要由端粒酶RNA組分（telomerase RNA, TR），端粒酶相關(guān)蛋白和端粒酶催化亞基（telomerase reverse transcriptase, TERT）三部分組成，其主要功能是通過(guò)防止染色體復(fù)制時(shí)端粒的丟失進(jìn)而維護(hù)細(xì)胞的有絲分裂增殖能力[8-10]。正常人體細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中由于染色體不完全復(fù)制，染色體末端端粒序列隨著有絲分裂次數(shù)的增加逐漸縮短，直到某個(gè)臨界點(diǎn)，端粒不能保護(hù)染色體末端的重組和降解，細(xì)胞退出增殖周期以至衰老。而端粒酶最主要的功能便是防止染色體復(fù)制導(dǎo)致的端粒丟失進(jìn)而維持細(xì)胞的有絲分裂增殖能力。近年來(lái)，大量研究證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存在，腫瘤干細(xì)胞像正常干細(xì)胞一樣通過(guò)相同的調(diào)控因子調(diào)控細(xì)胞的自我更新功能和多向分化潛能，腫瘤干細(xì)胞的存在被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及放化療失敗的因素之一。因此，探討端粒酶在乳腺癌干細(xì)胞中的作用機(jī)制顯得尤為必要。在本研究中，我們通過(guò)球囊培養(yǎng)的方法富集乳腺癌干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)乳腺干細(xì)胞中端粒酶催化亞基hTERT高表達(dá)，敲除hTERT后球囊形成能力明顯下降。這提示端粒酶調(diào)控了乳腺癌干細(xì)胞的自我更新功能，為乳腺癌的臨床治療提供了新的靶標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1]隋曉英. 乳腺癌臨床病理資料分析[J]. 中國(guó)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2015，7(4)：172-173.

[2] YuanY，ShenH，F(xiàn)ranklinDS，et al. Invivosel-frenewing divisions of haematopoietic stem cells are increased in the absence of the early G1-phase inhibitor p18INK4C[J]. Nature Cell Biology， 2004(6)：436-442.

[3] Yang YM， ChangJW. Current status and issues in cancer stem study[J]. Cancer Investigation， 2008(26)：741-755.

[4] Soltysova A，A ltanerova V，A ltaner C. Cancer stem cells[J]. Neoplasma，2005，52(6)：435-440.

[5] Pooley KA，Sandhu MS，Tyrer J，Shah M，Driver KE Luben RN，et al. Telomere length in prospective and retrospective cancer case-control studies[J]. Cancer Res，2010，70(8)：3170-3176.

[6] Jones AM，Beggs AD，Carvajal-Carmona L，F(xiàn)arrington S，Tenesa A，Walker M，et al. TERC polymorphisms are associated both with susceptibility to colorectal cancer and with longer telomeres[J]. Gut，2012，61(2)：248-254.

[7] Engelhardt M，Drullinsky P，Guillem J，Moore MA. Telomerase and telomere length in the development and progression of premalignant lesions to colorectal cancer[J]. Clin Cancer Res，1997，3(11)：1931-1941.

[8] Meeker AK，Hicks JL，Iacobuzio-Donahue CA，Montgomery EA，Westra WH，Chan TY，et al. Telomere length abnormalities occur early in the initiation of epithelial carcinogenesis[J]. Clin Cancer Res，2004，10(10)：3317-3326.

[9] Pampalona J，Soler D，Genesca A，Tusell L. Whole chromosome loss is promoted by telomere dysfunction in primary cells[J]. Genes Chromosomes Cancer ，2010，49(4)：368-378.

[10] Zou Y，Misri S，Shay JW，Pandita TK，Wright WE. Altered states of telomere deprotection and the two-stage mechanism of replicative aging[J]. Mol Cell Biol，2009，29(9)：2390-2397.

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.25.043

【文章編號(hào)】1674-9308（2015）25-0063-02

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B

【中圖分類號(hào)】R737.9