·實驗研究·

胡蘆巴膠降解工藝研究

賀少龍1，馮軍1，洪彤彤1，隋宏1,2，王文蘋1,2,3

(1.寧夏醫(yī)科大學藥學院，寧夏 銀川 750001；2.寧夏回藥現代化工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004；

3.回醫(yī)藥現代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

摘要：目的優(yōu)選胡蘆巴膠的降解方法及工藝，獲得質量穩(wěn)定可控的低分子量多糖。方法 以總糖和還原糖含量以及黏度為評價指標，比較酸水解、超聲輔助、酶解等工藝，優(yōu)選最佳條件。并依據紫外、紅外及差示掃描熱圖譜對產物進行初步評價。結果不同降解工藝所得還原糖得率分別為酶解52.41%、超聲輔助42.19%、酸解24.59%；以纖維素酶用量10 U·mg-1、50 ℃處理150 min時，降解效果最佳。重復實驗表明該工藝穩(wěn)定可控， 紫外、紅外及DSC圖譜無明顯差異，峰位基本不變。結論酶法降解胡蘆巴制備低分子量多糖，方法簡便、高效、易于控制。

關鍵詞：胡蘆巴膠；酶法降解；黏均分子量；低分子量多糖

基金項目：國家自然科學

作者簡介：賀少龍，男，研究方向：新型載藥材料及給藥系統(tǒng)研究，E-mail：15296907978@163.com

通訊作者：王文蘋，女，博士研究生，教授，研究方向：新型載藥材料及給藥系統(tǒng)研究，Tel：0951-6880581，E-mail：wangwenpingg@sina.com

中圖分類號：R284.2文獻標識碼：A

Study on degradation process of fenugreek gum

HEShao-long1,FENGJun1,HONGTong-tong1,SUIHong1,2,WANGWen-ping1,2,3

(1.SchoolofPharmacy,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750001,China;2.NingxiaEngineering&

TechnologyResearchCenterForModernizationofHuiMedicine,Yinchuan750004,China;

3.KeyLabofHuiEthnicMedicineModernization,MinistryofEducation,Yinchuan750004,China)

Abstract：ObjectiveTo optimize the degradation process of fenugreek gum and to obtain low-molecular-weight polysaccharide with stable and controllable quality.Methods Taking total sugar,reducing sugar content and viscosity parameter as evaluating index,degradation methods of traditional acid hydrolysis,ultrasound-aided acid hydrolysis and enzymatic degradation were compared and the process conditions were further optimized. The fenugreek gum and its degradation products were characterized by UV,IR and DSC spectrometry respectively.Results The reducing sugar content of different degradation methods were 52.41% for enzymatic degradation,42.19% for ultrasound-aided acid hydrolysis and 24.59% for traditional acid hydrolysis. The optimum process was as follows:Fenugreek gum solution was treated with 10 U cellulose at 50 ℃ for 150 min.Repeated experiments showed that the degradation process was stable and controllable.No significant differences were found in the UV,IR or DSC spectrums between fenugreek gum and its degradation products.Conclusion Enzymatic degradation of fenugreek gum turned was an efficient,simple and controllable method.

Key words:Fenugreek gum;Enzymatic degradation;Viscosity-average molecular weight;Low-molecular-weight polysaccharide

胡蘆巴膠(Fenugreek gum,以下簡稱FG)源于胡蘆巴種子內胚乳部分，屬中性黏多糖，主要成分為半乳甘露聚糖，以β-D-1,4糖苷鍵鏈接形成主鏈[1]。國內現多將胡蘆巴膠用作工業(yè)增稠劑，食品級增稠性、保水性添加劑等[2]，但對胡蘆巴膠作為生物醫(yī)藥材料的相關研究較少。近年來發(fā)現不僅天然多糖自身具有食用或醫(yī)藥價值，且其低分子量多糖也具有獨特的藥理活性。例如有學者對3種不同天然來源的半乳甘露聚糖進行比較，結果表明半乳糖基的比例越高,其降血糖和降血脂的作用就愈強[3～5]。低分子量多糖具有良好的生理功能，在食品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)有著廣泛的應用[6]，受到研究者的普遍關注。因此，本文擬對胡蘆巴膠進行降解、制備低分子量多糖，優(yōu)選方法和工藝，以期為胡蘆巴膠相關新產品的開發(fā)和應用奠定基礎。

1材料和方法

1.1儀器與設備DF-101s恒溫培養(yǎng)搖床(上海恒科學儀器)；TDL-40B離心機(上海安亭)；UV-2450紫外分光光度計(日本島津)；DV-III流變儀(美國博勒飛)；烏氏黏度計(上海亞太技術玻璃公司，91683501)；TENSOR37傅立葉紅外光譜儀(德國布魯克公司)；UV-2450紫外分光光度計(日本島津)；TGA/DSC同步熱分析儀(南京大展機電技術研究所)。

1.2材料與試劑胡蘆巴種子(亳州蜀中藥業(yè)有限公司，批號：20110205)；纖維素酶(上海源葉生物科技有限公司，酶活力≥35 U·mg-1)；果膠酶(北京索萊寶公司，酶活力≥40 U·mg-1)；甘露聚糖酶(江蘇銳陽生物，酶活力≥60 000 U·mg-1)；葡萄糖標準品(中國藥品生物制品檢定所，含量≥98%，批號：MUST-12122601)；無水乙醇(天津北聯試劑公司，批號：20130620)；鹽酸(白銀銀環(huán)化學制劑廠，批號：20100203)；氫氧化鈉(天津市大茂化學試劑廠，批號：20100527)；檸檬酸(北京化工廠，批號：890815)；亞硫酸鈉(天津市福晨化學試劑廠，批號：20040906)；酒石酸鉀鈉(天津市風船化學試劑科技有限公司，批號：20101220)，所用水均為蒸餾水，由寧夏醫(yī)科大學動力中心提供。

1.3總糖及還原糖含量方法[7,8]總糖含量的測定：取待測品100 mg精密稱定，置于帶塞燒瓶中，再各加入10 mL 6 moL·L-1HCl溶液和15 mL蒸餾水混勻，在沸水浴中密封加熱30 min后。以流水冷卻后，加入酚酞指示劑2滴，用10%NaOH溶液中和至溶液呈淡紅色，轉移至100 mL容量瓶中加水定容，過濾取續(xù)濾液待測。

還原糖的測定：取待測樣品溶液1.0 mL置 25 mL比色管中，加入1.5 mL蒸餾水、3.0 mL DNS試劑混勻，于沸水浴中煮沸10 min，取出立即用冰水浴冷卻至室溫，加水至刻度，搖勻、待測。

DNS法測定波長的確定：分別取葡糖糖標準液(1 mg·mL-1)0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于比色管中，加水至2.5 mL，再精密加入DNS試劑3.0 mL，混勻，于100 ℃水浴10 min，流水冷卻，加水至刻度、搖勻，于200～800 nm處進行掃描，結果空白樣品和對照品均在 490 nm 有最大吸收，故確定490 nm為檢測時所用波長。

上述樣品分別在490 nm波長處測吸光度值，并按下式(1)計算樣品中總糖或還原糖的含量。所得結果按式(2)計算還原糖得率。

含量(%)=(a×C×D)/W×100

(1)

還原糖得率=還原糖含量(mg)/總糖含量(mg)×100%

(2)

式中a=0.9，為校正系數；C為樣品濃度；D為稀釋倍數；W為樣品重量(mg)。

以葡萄糖為標準品制得工作曲線為：A=20.177C-0.091 9，相關系數R2=0.998 1，結果顯示，在0～40 μg·mL-1范圍內，總糖與還原糖的含量同吸光度成正比，且相關性良好。

1.4黏均分子量的測定取100 mg 降解產物精密稱定，加0.2 mol·L-1NaCl 水溶液配制濃度在1.1～1.5 g·cm-3的范圍內的系列溶液。取10 mL 該溶液置烏氏黏度計中，在30 ℃水浴恒溫的條件下，用秒表測定下落的時間，根據Mark-Houwink經驗式(3)[9,10]計算黏均分子質量。

(3)

其中，η 為溶液黏度，Mη為黏均分子質量，K=7.5×10-2，α=0.662。

1.5黏度的測定將樣品配制成1%的溶液，選用DV-III流變儀(4號轉子，60 rpm)室溫下測定黏度。

1.6降解方法及工藝的選擇分別采用酸解、超聲輔助酸解、酶解等方法降解胡蘆巴膠，以還原糖得率以及黏均分子量為評價指標，優(yōu)選最佳降解方法和合成工藝。

1.6.1酸解方法取2%的胡蘆巴膠糖溶液，加入10 mL 10%鹽酸溶液，置于50 ℃水浴上恒溫水解4 h后，冷卻并調pH至中性，取1 mL用DNS法測定還原糖的含量，將剩余降解液用90%的乙醇沉淀，放置烘箱干燥備用。

1.6.2超聲輔助酸解方法超聲輔助酸解方法同上，在加入10%鹽酸溶液后，置于超聲提取器中超聲處理。其他處理與傳統(tǒng)酸解均相同。

1.6.3酶解方法配制2%的胡蘆巴膠糖溶液，加入酶液后，于50 ℃下降解一定時間，煮沸5 min滅活酶，放冷備用[11]。分別考察酶的種類、酶質量濃度、時間等因素對樣品還原糖含量等指標的影響(n=3)。

1.6.4結構分析分別利用紫外、紅外及DSC掃描胡蘆巴膠及降解產物，比較所得圖譜，對降解產物進行初步評價。

2結果與分析

2.1不同降解方法的考察將各種工藝降解后的低分子量多糖用90%的醇沉，干燥后復溶，分別測吸光度值并按“1.3”項下公式(1)、(2)計算總糖和還原糖含量、還原糖得率。根據“1.4”項下的方法，計算FG多糖及各工藝降解后低分子量多糖的黏均分子量，結果見表1。

表 1　不同降解工藝所得還原糖得率及黏均分子量( n=3)

注：-表示未計算得出

由表1可知，不同方法降解產物還原糖得率分別為：52.41%、42.19%、24.59%，酶解>超聲輔助>酸解；黏均分子量為：纖維素酶(50 885.59 Da)> 酸解(4 131.56 Da)。推測其原因可能是，鹽酸水解條件強烈、降解完全，但易破壞糖的結構，因此所得產物黏均分子量較?。欢曒o助酸解破壞糖的結構更徹底，工藝重現性較差，使得溶液在烏式黏度計中下落時間存在很大差異，不能有效計算出黏均分子量。酶解方法簡便、省時，且還原糖得率最高。因此選擇酶解的方法。

2.2酶種類的優(yōu)選

2.2.1不同酶的選擇考察不同酶種類對產物還原糖含量的影響，結果如圖 1 。

圖1　酶種類對還原糖含量的影響

結果表明，當采用單一酶時，所得還原糖含量依次為：纖維素酶>果膠酶>甘露聚糖酶；當采用果膠酶及纖維素酶和果膠酶的混合酶時，所得產物還原糖含量差異不顯著，且均低于纖維素單一酶。推測可能是因為酶的作用活性具有高度的專一性。果膠酶本質上是聚半乳糖醛酸水解酶,降解多糖后主要生成的是β-半乳糖醛酸,所以單糖的量少；甘露聚糖酶水解α-半乳糖殘基在主鏈中的位置、含量、酯?；某潭扔嘘P，若完全水解甘露聚糖，需要與其他酶協同作用[9]。而纖維素酶恰是分解β-1,4-結合的葡萄糖苷鍵的纖維素物質[12]。因此，選擇纖維素酶進一步的考察。

2.2.2纖維素酶用量的考察取2% FG溶液，分別加入不同體積的纖維素酶液，考察酶用量對所得產物還原糖含量的影響，結果見圖 2 。

圖2　酶用量對還原糖含量的影響

結果表明，還原糖含量隨著酶用量的增加而升高，當加入2 mL(100 U·mL-1)的纖維素酶溶液時，產物還原糖含量最高、基本達到平衡。因此選用加入酶量10 U·mg-1作進一步的考察。

2.2.3酶解時間的考察結果見圖3。

圖3　不同時間點降解液的黏度

如圖3所示，酶解過程中體系黏度值隨酶解時間的延長而迅速降低，30 min后，黏度值變化趨于平緩，150 min后體系黏度值幾乎不再變化，這一現象可能是由于對纖維素酶敏感的β-1,4糖苷鍵首先在酶的作用下迅速發(fā)生斷裂，分子量降低，導致黏度值下降。而其余機團對酶的敏感性較弱，因此降解過程后期黏度變化較小[13]。綜合考慮降解效率確定最佳酶解時間為150 min。

2.3胡蘆巴膠及其酶解產物結構初步分析胡蘆巴膠與降解低分子量多糖紫外、紅外及差示掃描熱掃描結果如圖4所示，各圖譜無明顯差異，峰位基本不變,表明降解后結構未發(fā)生本質變化。其中，紫外光譜掃描圖相似，均在260 nm和280 nm有吸收峰，說明各組分仍含有微量核酸與蛋白質。IR圖譜顯示胡蘆芭膠與降解低分子量多糖均在3 436、2 925、1 746、1 645、1 541、1 152、1 076、1 023 cm-1處有較強的吸收峰[14]，低分子量多糖的紅外譜圖與原胡蘆巴膠的極為相似，只是1 746、1 541 cm-1處的特征吸收峰變強,說明酶解后胡蘆巴膠單元基本結構沒有發(fā)生明顯變化，只是糖苷鍵斷裂，-OH增多；DSC顯示胡蘆巴膠 (圖4中a) 在90～150 ℃之間出現一個較明顯放熱峰,峰頂溫度為125 ℃，在125 ℃兩側出現兩個吸熱峰。纖維素酶降解產物(圖4中b)與胡蘆巴膠峰形基本相同，峰強均減弱，在270 ℃放熱峰消失?？梢婋S著分子量降低，胡蘆巴膠的聚集狀態(tài)發(fā)生了改變，規(guī)整性減弱，分子結構的結晶區(qū)受到一定程度的破壞，結晶度降低，樣品分解時放熱峰峰強減弱。

圖 4　UV、IR及DSC掃描圖 a.胡蘆芭膠；b.低分子量多糖

3討論

3.1目前大分子多糖主要采取化學降解法、酶降解法和物理降解法3種方法水解[15]?；瘜W降解一般應用硫酸降解、稀鹽酸法等，化學降解的原理是酸性溶液能引起多糖中糖苷鍵的斷裂,使多糖降解為低分子片段，但相對而言,化學降解條件不易控制,易引起多糖結構破壞。超聲波也可引起多糖解聚，多糖經控制性超聲波處理,部分解聚,分子量降低,同時黏度下降,基本重復結構不變,保持了原有活性。但超聲波輻射的結果表明,無論輻射時間長短,解聚物具有相當窄的分子量分布，不利于推廣應用。酶降解反應因其高度的專一性、高效性以及降解條件及過程易于控制、無副反應等,在多糖降解中已逐漸受到重視。本文考察了酸解、超聲輔助、酶解的方法對降解產物的影響，最終優(yōu)選了酶法降解。

3.3還原糖指含有游離醛基、酮基和半縮醛、羥基而具有還原作用的單糖和雙糖[19]，而3,5-二硝基水楊酸(DNS)法是測定還原糖含量的常用方法。本文采用DNS測定降解產物中還原糖含量時，為了降低部分二糖等還原性糖對測定結果的影響，在測定過程中，重復測量3次，計算回收率，結果顯示，平均回收率為97.84%，RSD=0.96%，表明用DNS法測定降解產物還原糖含量準確、可靠。

4結論與展望

本文以還原糖含量以及黏均分子量為指標，結合黏度，綜合考察了不同降解方法和工藝條件對所得產物的影響，優(yōu)選制備胡蘆巴膠低聚糖最佳條件，其最佳酶解溫度50 ℃，時間150 min，用量10 U·mg-1。初步結構分析表明，分子量顯著下降，但結構圖譜說明酶解后其結構沒有發(fā)生顯著改變。酶法簡便，可控、高效，所得胡蘆巴膠低分子量多糖可用于進一步活性評價，有利于胡蘆巴膠相關新產品的開發(fā)和利用。

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