白　雪，張亞鋒，艾　蕓，李爾春

(西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安　710054)

?

HPLC-MS/MS法快速檢測中成藥及保健食品中6種減肥類非法添加化學(xué)成分

白雪，張亞鋒，艾蕓，李爾春

(西安市食品藥品檢驗(yàn)所，西安710054)

摘要：目的建立HPLC-MS/MS方法快速檢測中成藥及保健食品中6種減肥類違法添加化學(xué)成分的方法。方法試樣用甲醇提取后，經(jīng)Agilent Eclipse XD8-C18柱分離，以1 mL·L-1甲酸溶液和甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，采用ESI電離源和MRM掃描方式。結(jié)果該方法可以準(zhǔn)確檢測中成藥及保健食品中6種非法添加成分，檢測限為0.1～1.0 ng。結(jié)論該方法簡便、靈敏、快速，適用于減肥類保健品和中成藥中非法添加成分的檢測確證。

關(guān)鍵詞：中成藥；保健食品；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

近年來，在部分聲稱具有減肥功效的中成藥及保健食品中，發(fā)現(xiàn)含有非法添加的化學(xué)成分。常見的有咖啡因、酚酞、呋塞米、鹽酸西布曲明、鹽酸芬氟拉明和鹽酸麻黃堿6種。由于保健食品和中成藥市場產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊、監(jiān)管難度較大，不法分子受利益驅(qū)使添加上述違禁化學(xué)成分，極大地威脅了消費(fèi)者的生命健康。上述成分主要通過降低食欲、刺激腸壁、迫使中樞神經(jīng)興奮和刺激新陳代謝這幾方面來達(dá)到快速減肥的目的，長期服用會(huì)危害健康。檢測此類成分現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有2個(gè)，國家食品藥品監(jiān)督管理局《關(guān)于印發(fā)保健食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測有關(guān)檢測目錄和檢測方法的通知》附件二中只針對(duì)5種成分進(jìn)行篩查，而在《國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件2006004》中也僅檢測麻黃堿等3種成分。近年文獻(xiàn)報(bào)道[1-5]普遍用多個(gè)流動(dòng)相體系檢測此類成分，方法繁瑣、耗時(shí)長、分離度較差，且并未對(duì)樣品與對(duì)照品的相對(duì)離子豐度比一致性做出探討，容易造成假陽性樣的判定結(jié)論。本方法通過LC-MS/MS技術(shù)，運(yùn)用一個(gè)流動(dòng)相體系同時(shí)檢測6種非法添加的化學(xué)組分，出峰時(shí)間快、分離度改善、定性準(zhǔn)確，為中成藥和保健食品的監(jiān)管提供了技術(shù)支撐。

1儀器與試藥

1.1儀器美國Agilent 1200-G6410B三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，ESI電離源。

1.2試藥對(duì)照品：鹽酸西布曲明(100624-200401)、酚酞(100091-199601)、鹽酸麻黃堿(171241-200506)、呋塞米(100544-201102)、鹽酸芬氟拉明(100073-200002)、咖啡因(171215-200608)，均購自中國藥品生物制品檢定所；流動(dòng)相中所用甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1工作條件

2.1.1色譜條件色譜柱：Agilent Eclipse XD8-C18，(150 mm×2.1 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃。進(jìn)樣量：10 μL；流速:0.5 mL·min-1。流動(dòng)相：甲醇(A)-1 mL·L-1甲酸水溶液(B)，梯度洗脫：0 min，10%A；3 min，42%A；5 min，42%A；6 min，64%A；9 min，64%A；10 min，10%A。

2.1.2質(zhì)譜條件離子源為ESI源；咖啡因、鹽酸芬氟拉明、酚酞、鹽酸麻黃堿和鹽酸西布曲明用正離子模式監(jiān)測；呋塞米用負(fù)離子模式監(jiān)測；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；霧化氣壓力為20 psi，干燥氣流量為 12 L·min-1；干燥氣溫度為350 ℃，以高純氮?dú)鉃殪F化氣和干燥氣。優(yōu)化毛細(xì)管電壓和碰撞能量，以最高相對(duì)離子豐度的子離子作為檢測離子，各化合物優(yōu)化結(jié)果見表 1；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，監(jiān)測范圍50～400。

表16種化學(xué)成分的質(zhì)譜參數(shù)

Tab.1 The MS parameters of 6 kinds of chemical constituents

名稱母離子(m/z)主要碎片離子(m/z)毛細(xì)管電壓碰撞能量鹽酸麻黃堿166.1116.88010148.1咖啡因195.1138.010020110.1鹽酸芬氟拉明232.1159.010010187.1呋塞米328.6284.210010204.8酚酞319.1225.010030197.0鹽酸西布曲明280.1139.010010125.0153.0

2.2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備分別稱取呋塞米、鹽酸芬氟拉明、咖啡因、鹽酸麻黃堿、酚酞和鹽酸西布曲明對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的混合溶液。

2.3供試品溶液的制備若供試品為片劑或丸劑，細(xì)致研磨粉碎，稱取一次服用量；若供試品為膠囊劑，取數(shù)粒，取其內(nèi)容物，研細(xì)，稱取1次口服劑量；若供試品為口服液，量取1次口服劑量；若供試品為軟膠囊，預(yù)先稱取整個(gè)膠囊的質(zhì)量，再用注射器取其內(nèi)容物。將上述樣品分別置于50 mL量瓶中，加甲醇30 mL，渦旋10 min，再經(jīng)超聲提取15 min，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜濾過( 必要時(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，待用。

2.4測定法按照2.1項(xiàng)工作條件取供試品、對(duì)照品溶液各10 μL 進(jìn)樣，進(jìn)行測定分析。

2.5結(jié)果分析按照上述條件對(duì)某批供試品溶液測定，其色譜峰的保留時(shí)間與混合對(duì)照品溶液中鹽酸西布曲明、酚酞和咖啡因一致，對(duì)該供試品溶液進(jìn)行多反應(yīng)離子監(jiān)測掃描，供試品的特征碎片離子均與對(duì)照品一致，相應(yīng)質(zhì)譜圖見圖1～3，通過計(jì)算對(duì)照品和樣品相對(duì)離子豐度比，且相對(duì)離子豐度比在允許偏差范圍內(nèi)，可判定該供試品中含有西布曲明、酚酞和咖啡因。見表2。筆者針對(duì)市場上流通的42批減肥類中成藥及保健食品進(jìn)行檢測，有11批次檢出非法添加化學(xué)成分，其中添加種類最多的為酚酞和咖啡因，其次為鹽酸西布曲明，鹽酸麻黃堿未檢出。

表2使用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜時(shí)相對(duì)離子豐度最大容許誤差

Tab.2 The maximum permissible error of the relative abundance when using LC-MS/MS

相對(duì)離子豐度/%>50>20～50>10～20≤10最大允許偏差/%±20±25±30±50

圖1對(duì)照品中6種化學(xué)成分的離子流圖

1.鹽酸麻黃堿；2.咖啡因；3.鹽酸芬氟拉明；4.呋塞米；5.酚酞；6.鹽酸西布曲明

Fig.1 MRM ion current graphs of 6 chemical components in reference substances

1.ephedrine hydrochloride；2.caffeine；3.fenfluramine hydrochloride；4.furosemide；5.phenolphthalein；6.sibutramine hydrochloride

圖2樣品離子流圖

2.咖啡因；5.酚酞；6.鹽酸西布曲明

Fig.2 MRM ion current graphs of the sample

2.caffeine；5.phenolphthalein；6.sibutramine hydrochloride

圖3樣品碎片離子流圖

A.酚酞；B.咖啡因；C.鹽酸西布曲明

Fig.3 Fragment ion chromatograms of the sample

A.phenolphthalein；B.caffeine；C.sibutramine hydrochloride

表3對(duì)照品及樣品豐度比

Tab.3 The abundance ratio of reference to sample

準(zhǔn)分子離子碎片離子對(duì)照品峰面積對(duì)照品豐度比樣品峰面積樣品豐度比195.1138.059084.98120714.91110.111862456319.1225.049963.70105423.69197.013522858280.1139.058341.3213578261.33125.044191024067

2.6檢測限用甲醇溶液將對(duì)照品逐步稀釋，并按照2.1項(xiàng)工作條件進(jìn)行測定，當(dāng)信噪比(S︰N)為 3 時(shí)，這6種成分的檢出限均< 1.5 ng。

3討論

① 研究時(shí)分別考察了甲酸銨-甲醇、乙酸銨-甲醇，甲酸銨-乙腈溶液、乙酸銨-乙腈溶液，甲酸-甲醇、乙酸-甲醇，甲酸-乙腈溶液、乙酸-乙腈體系作為流動(dòng)相，并將銨溶液濃度設(shè)定為5～20 mmol·L-1，酸溶液濃度設(shè)定為0.1%～0.5%，并嘗試流動(dòng)相比例調(diào)整，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 mL·L-1甲酸-甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫可在較短的時(shí)間內(nèi)分離并且分離度有所提高(α≥1.5)，改善了其他體系運(yùn)用過程中出現(xiàn)的柱壓較高、峰重疊、基線噪音較大和管路易堵塞等問題。

② 本方法通過計(jì)算定性離子與定量離子豐度比，更加確認(rèn)了樣品的陽性結(jié)果，避免出現(xiàn)日常檢驗(yàn)工作中假陽性樣的判定，大大節(jié)約了檢驗(yàn)時(shí)間，提高了檢驗(yàn)效率。

③現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)資料未涉及相對(duì)豐度比范圍討論，本文參考現(xiàn)行LC-MS/MS法測定標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為應(yīng)當(dāng)對(duì)此進(jìn)行補(bǔ)充：在同等實(shí)驗(yàn)條件下，樣品液與標(biāo)準(zhǔn)液中待測物質(zhì)色譜峰相對(duì)保留時(shí)間不超過2.5%，扣除背景色譜后，目標(biāo)物的離子對(duì)均出現(xiàn)，且與對(duì)照品的相對(duì)離子豐度允許偏差應(yīng)當(dāng)在表2的規(guī)定范圍內(nèi)，即可判斷樣品中存在被測物。

參考文獻(xiàn)：

[1]葛寶坤，張群謙，趙孔祥.高效液相色譜法同時(shí)測定減肥類保健食品中鹽酸西布曲明和酚酞[J].藥物分析雜志，2012，32(11) : 2034-2037.

[2]權(quán)伍英，欒燕，張欣. LC-MS/MS 法檢測保健食品中的鹽酸芬氟拉明和鹽酸西布曲明[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17(1) : 9-12.

[3]陳稚，吳都督.高效液相色譜/電噴霧質(zhì)譜測定減肥保健品中的鹽酸西布曲明[J].化學(xué)研究，2010，21(3): 83-85.

[4]陳祥輝，李文明，李艷清.中成藥非法添加化學(xué)成分檢測方法研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，17(6): 126-128.

[5]孟新芳，徐長根，耿慶光，等. HPLC法測定復(fù)方鼻炎膏中鹽酸麻黃堿和鹽酸苯海拉明的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2012，27(3):216-218

Rapid detection of six chemical components illegally added in Chinese patent medicines and slimming functional foods by HPLC-MS/MS

BAI Xue，ZHANG Yafeng，AI Yun，LI Erchun (Xi′an Institute for Food and Drug Control，Xi′an 710054，China)

Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC-MS/MS method for rapid detection of the illegal addition of 6 chemical components in Chinese patent medicines and slimming functional food. MethodsThe samples are extracted by methanol，separated on an Agilent Eclipse XD8-C18column with the gradient elution of 1 mL·L-1formic acid and methanol as the mobile phases. The electrospray ionization (ESI) source in positive or negative ion mode was used for multiple reaction monitoring (MRM) . Results The method for the rapid detection of six chemical components illegally added in Chinese patent medicines and slimming functional food was established，and the limits of detection were all below 1.5 ng. ConclusionThe method is simple, sensitive and fast for detecting and confirming the illegally added chemical components.

Key words:Chinese patent medicines; slimming functional food；HPLC-MS/MS

收稿日期：(2015-03-05)

中圖分類號(hào)：R917

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)01-0048-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.016