張曉倩， 劉 洋， 呂 瀟， 楊仁杰， 李夢婷， 劉海學(xué)

（1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院， 天津300384； 2.天津農(nóng)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院， 天津300384）

向日葵（H.annuus L.），別名太陽花，是菊科向日葵屬的植物。在16世紀(jì)末或17世紀(jì)初傳入我國，主產(chǎn)區(qū)分布在東北、西北和華北地區(qū)，如內(nèi)蒙古、吉林、遼寧、黑龍江、山西省等。向日葵的種子含油量極高（48%～55%），是重要的油料作物，也被譽(yù)為世界第三大油料作物。向日葵種子中含有球蛋白、清蛋白和油脂體蛋白等豐富的蛋白質(zhì)，是優(yōu)質(zhì)食用油和優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源之一［1］。向日葵作為植物油脂和蛋白質(zhì)的重要來源，在有效供給油脂和蛋白質(zhì)、改善食物結(jié)構(gòu)、促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)和加工業(yè)發(fā)展等方面起重要作用［2］。蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)，是一種檢測和分析蛋白質(zhì)的生化手段，是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離與展示的分離技術(shù)［3］，但探究出一套能夠分離不同種植物種子間的差異蛋白的雙向電泳體系，仍是當(dāng)今需要解決的難題。本實(shí)驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì)，對影響向日葵蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)中的3個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行了探討，以期為今后向日葵蛋白質(zhì)組學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)，也為其它油類植物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)分析測試中心保存干燥的向日葵種子。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白的提取

蛋白的提取方法有很多種，如改良水提取法和有機(jī)溶劑提取法［4］、三氯乙酸／丙酮沉淀法和酚提取法［5］等，但根據(jù)文獻(xiàn)和反復(fù)試驗(yàn)表明，這些方法都存在樣品用量大、提取雜質(zhì)較多、溶解非常困難等問題。為了克服這些弊端，向日葵種子蛋白提取采用的是上海生物化工科技發(fā)展有限公司（簡稱上海生工）植物蛋白提取試劑盒。具體步驟是：取干燥的向日葵種子剝?nèi)テぃ玫肚腥》N子尖端約3mm（100mg），放入研缽中，加入適量液氮迅速研碎，然后按試劑盒操作說明進(jìn)行操作，最后加入700μL提前配置好的裂解液，漩渦震蕩使沉淀懸浮，－20℃過夜溶解。

1.2.2 蛋白定量

使用Thermo公司生產(chǎn)的超微量核酸蛋白檢測儀，采用紫外吸收A280法進(jìn)行蛋白定量，觀測結(jié)果。試樣重復(fù)測定3次，最后取平均值。

1.2.3 水 化

將樣品取出解凍后，4℃，16 000r／min，離心5min，備用。參照GE說明書，采用18cm長的IPG膠條，水化液體積為350μL。按表1所示，依次加入樣品和所需試劑至離心管中，混勻。然后將水化液加到水化槽中，提前從－20℃冰箱中取出膠條，膠面朝下放入槽中，上面加一層覆蓋油，蓋好蓋子，水平放置12h。

表1 向日葵種子蛋白樣品水化表

1.2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對向日葵種子蛋白分析采用L4（23）正交表進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，總計(jì)安排組織了4次實(shí)驗(yàn)。因子水平安排見表2。其中E為膠濃度，F(xiàn)為聚焦時(shí)間，G為上樣量。正交設(shè)計(jì)共4個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。向日葵種子蛋白雙向電泳完畢后，統(tǒng)計(jì)差異蛋白點(diǎn)個(gè)數(shù)。運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行正交設(shè)計(jì)和方差分析。

表2 L4（23）向日葵種子蛋白正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5 蛋白質(zhì)雙向電泳

第一向固相pH值梯度等電聚焦電泳（IEF）：將水化好的IPG膠條放入IPGphor 3（GE－Healthcare）（垂直電泳測序系統(tǒng)）的電泳槽中，膠面朝上，參照GE公司操作手冊［6］進(jìn)行，設(shè)定2個(gè)電泳時(shí)間，參數(shù)設(shè)定分別為：20℃、100V（30min）、100～500V 梯度（1h）、500～1 000V 梯度（1h）、1 000～6 000V 梯度（2h）、6 000V 保持（30min），總共一向電泳時(shí)間為5h；20℃、100V（30min）、100～500V 梯度（1h）、500～1 000V梯度（1h）、1 000～2 000V 梯度（1h）、2 000～6 000V 梯度（2h），6 000～8 000V 梯度（1.5h），8 000 V保持（30min）總共一向電泳時(shí)間為7.5h。

將等電聚焦完成的IPG膠條進(jìn)行平衡。膠條的平衡分兩步進(jìn)行：第一步用含有1%DTT的平衡液，平衡15min；第二步用含有2.5%碘乙酰胺的平衡液，平衡15min，膠條平衡過程中須在水平搖床上不停搖晃。

第二向SDS－PAGE垂直板電泳：依據(jù)設(shè)計(jì)好的正交試驗(yàn)需要，分別配制厚度為1mm、膠濃度為T＝10%和12.5%的聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，將平衡好的膠條移入玻璃板中，再用加溴酚藍(lán)的0.5%的瓊脂糖溶液封頂。放入 Ettan DALTsix電泳儀（GEHealthcare）進(jìn)行電泳。電泳開始時(shí)，電流設(shè)定為10mA／板，待溴酚藍(lán)前沿移動(dòng)到凝膠上后，加電流加至30mA／板，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿跑至距膠底部0.5～1cm處時(shí)，電泳完畢［7］。

1.2.6 凝膠染色

電泳結(jié)束后，迅速啟膠，將凝膠在水中固定1min，用考馬斯亮藍(lán)染液避光染色8～10h后，換為水脫色，脫色至背景無色透明，蛋白點(diǎn)清晰為止。

1.2.7 圖像掃描和分析

用Imagescanner型掃描儀進(jìn)行掃描，調(diào)整對比度，觀察膠圖情況使背景和蛋白點(diǎn)的對比度處于最佳狀態(tài)，掃描后保存圖片。另外，采用ImageMaster－Dplatinum 5.0分析軟件進(jìn)行分析，設(shè)置相同的參數(shù)條件：光滑度為5，最小區(qū)域值為8，顯著度為10，先自動(dòng)檢測所有蛋白點(diǎn)，后手動(dòng)剔除軟件錯(cuò)誤識(shí)別的蛋白點(diǎn)［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 向日葵種子差異蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

膠濃度、聚膠時(shí)間、上樣量對向日葵種子差異蛋白的影響試驗(yàn)（圖1、圖2、圖3、圖4）結(jié)果見表3。方差分析結(jié)果（表3）表明：不同膠濃度、不同上樣量之間向日葵種子差異蛋白點(diǎn)的數(shù)量存在顯著的差異（p＜0.05），而聚焦時(shí)間對向日葵種子差異蛋白點(diǎn)數(shù)量的影響不存在顯著差異（p＜0.05）。進(jìn)一步就膠濃度、上樣量對向日葵差異蛋白點(diǎn)的影響進(jìn)行分析（表4）可知，膠濃度12.5%水平下的向日葵差異蛋白點(diǎn)顯著高于10%水平；上樣量為3.5mg的向日葵差異蛋白點(diǎn)顯著高于2.5mg。由于因素內(nèi)水平極差（R）的大小能夠說明該因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度，由表4經(jīng)計(jì)算便得到參試3因素膠濃度、上樣量和聚膠時(shí)間的極差分別為32、14、3，因此，對向日葵種子差異蛋白影響的主次關(guān)系歸納為E＞G＞F，即依次是膠濃度、上樣量和聚膠時(shí)間，根據(jù)各因素水平的大小，可得到最優(yōu)水平組合為：E2F1G2。

2.2 上樣量對向日葵種子蛋白質(zhì)雙向電泳分辨率的影響

通過比較圖1和圖3發(fā)現(xiàn)，上樣量對向日葵蛋白質(zhì)雙向電泳分辨率有明顯影響。上樣量為2.5mg時(shí)（圖1），蛋白點(diǎn)雖沒有明顯拖尾現(xiàn)象，整個(gè)凝膠圖上的蛋白點(diǎn)多數(shù)呈圓形，但蛋白點(diǎn)數(shù)明顯偏少，只有46個(gè)，這就使得一些低豐度的蛋白點(diǎn)很難呈現(xiàn)，而低豐度蛋白點(diǎn)往往是生命活動(dòng)中起主要作用的功能蛋白。當(dāng)上樣量為3.5mg時(shí)（圖3），檢測出的蛋白點(diǎn)共116個(gè)，一些低豐度蛋白點(diǎn)清晰可見，且分布較均勻。因此，向日葵種子雙向電泳的上樣量以3.5mg左右為宜。

2.3 等電聚焦時(shí)間對向日葵種子差異蛋白的影響

由圖2可看出，當(dāng)一向等電聚焦時(shí)間為7.5h時(shí)，由于樣品沉淀時(shí)間過長會(huì)分解部分蛋白，使蛋白點(diǎn)丟失，況且聚焦過度也會(huì)造成蛋白點(diǎn)在凝膠上縱向拖尾，從而影響對蛋白點(diǎn)的整體分析。圖3顯示，當(dāng)一向等電聚焦時(shí)間為5h，蛋白點(diǎn)能得到較好的分離，蛋白點(diǎn)呈圓形，基本上沒有明顯拖尾現(xiàn)象，蛋白點(diǎn)數(shù)量較多，且均勻的分布在凝膠上。圖2和圖3的差異蛋白點(diǎn)約為29個(gè)，充分說明，雙向電泳一向聚焦時(shí)間為5h左右為宜。

表3 向日葵種子差異蛋白的L4（23）正交試驗(yàn)方案與結(jié)果

圖1 上樣量2.5mg、一向聚焦時(shí)間5h、聚丙烯酰胺凝膠濃度10%凝膠電泳

圖2 上樣量3.5mg、一向聚焦時(shí)間7.5h、聚丙烯酰胺凝膠濃度10%凝膠電泳

圖3 上樣量3.5mg、一向聚焦時(shí)間5h、聚丙烯酰胺凝膠濃度12.5%凝膠

2.4 膠濃度對向日葵種子差異蛋白的影響

從凝膠的掃描圖（圖1和圖3）可看出，10%濃度的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白點(diǎn)的范圍較小，而12.5%濃度的凝膠分離蛋白點(diǎn)的范圍要大很多，大范圍的分離凝膠上的蛋白點(diǎn)，可以使差異蛋白點(diǎn)在凝膠上呈現(xiàn)得更顯著。

3 討 論

通過對本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析及對蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)相關(guān)文獻(xiàn)的查閱可以看到，蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)是受多種因素影響的多步驟實(shí)驗(yàn)。因此，要想得到較高重復(fù)性和分辨率的2－DE圖譜，必須將電泳過程中的每一個(gè)因素都進(jìn)行優(yōu)化。

3.1 上樣量對2－DE圖譜的影響

適宜的上樣量不僅會(huì)使2－DE圖譜的蛋白點(diǎn)清晰，而且也決定了該種植物蛋白質(zhì)在2－DE圖譜上可以很好的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，若上樣量較少，則2－DE圖譜上分離得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)較少。其主要原因是水化時(shí)進(jìn)入IPG膠條的蛋白質(zhì)量較少，從而增加了低豐度蛋白的檢測難度；而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的上樣量高出其最適上樣量時(shí)，不僅不會(huì)增加2－DE圖譜上的蛋白點(diǎn)數(shù)，反而會(huì)比過低的上樣量檢測出的蛋白點(diǎn)更少。其原因可能是蛋白質(zhì)上樣量過高，在聚焦時(shí)容易造成蛋白質(zhì)在電泳槽中沉淀，不能很好地進(jìn)入IPG膠條中，進(jìn)而在2－DE圖譜上不能得到較清晰且數(shù)量較多的蛋白點(diǎn)［8］，這一點(diǎn)在陳蕊紅等［9］的實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。此外，蛋白質(zhì)樣品中的鹽離子含量過高，也會(huì)降低2－DE圖譜的分辨率，從而表現(xiàn)出蛋白質(zhì)點(diǎn)過少［9］的現(xiàn)象。

3.2 一向等電聚焦時(shí)間對2－DE圖譜的影響

適宜的一向等電聚焦時(shí)間，可以使不同的蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點(diǎn)不同均勻的分布在IPG膠條上。如果一向等電聚焦時(shí)間過短，IEF膠條中吸入的蛋白質(zhì)則不能完全的在IPG膠條中均勻分布，以致在對2－DE圖譜處理時(shí)得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)較少；而等電聚焦時(shí)間過長，則2－DE圖譜上又會(huì)出現(xiàn)較多的橫向條紋，降低了蛋白點(diǎn)分辨率，增加了其檢測的難度。除此之外，時(shí)間過長還會(huì)引起陰極漂移并丟失堿性蛋白，造成水平拖尾［10］。也有學(xué)者研究表明，蛋白質(zhì)樣品中的雜質(zhì)（主要是鹽離子）濃度超過100mmol／L時(shí)，也會(huì)在2－DE圖譜中出現(xiàn)大量的橫向條紋［11］。本實(shí)驗(yàn)也對不同的一向等電聚焦時(shí)間作為參變量進(jìn)行了對比，其中，聚焦時(shí)間為7.5h，同樣在2－DE圖譜中也出現(xiàn)了大量的橫、縱條紋，與上述研究者的結(jié)果一致，而5h的聚焦時(shí)間則明顯地減少了橫、縱條紋的干擾。本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過7.5h聚焦后的2－DE圖譜上蛋白點(diǎn)不是正常的接近于圓形，而是被嚴(yán)重的拉長了許多，原因可能是樣品中鹽離子濃度過高，導(dǎo)致IPG膠條中溶液電導(dǎo)率增大，從而引起電滲導(dǎo)致電壓不能升高，進(jìn)而影響聚焦效果。因此，在蛋白質(zhì)雙向電泳實(shí)驗(yàn)中做一向等電聚焦時(shí)必須除鹽。

圖4 上樣量2.5mg、一向聚焦時(shí)間7.5h、聚丙烯酰胺凝膠濃度12.5%凝膠

表4 膠濃度、聚膠時(shí)間及上樣量對向日葵種子蛋白的差異顯著性測驗(yàn)

3.3 其 它

在對向日葵種子蛋白進(jìn)行雙向電泳過程中還發(fā)現(xiàn)，聚焦電壓有時(shí)達(dá)不到預(yù)設(shè)值，原因除了蛋白質(zhì)樣品中含大量鹽離子之外，還有可能是由于外部環(huán)境因素造成。如在夏天高溫天氣進(jìn)行等電聚焦，室溫和聚焦儀存在很大的溫差，導(dǎo)致在聚焦板上凝結(jié)出大量水珠形成短路而造成聚焦電壓達(dá)不到預(yù)設(shè)值［12，13］。因此在夏天進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須控制外部溫度在20℃左右。

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