馬愛軍 王新安 孫志賓 趙艷飛 孫建華 王廣寧孟雪松 劉圣聰 張 濤

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點實驗室 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室 青島 266071;3. 大連天正實業(yè)有限公司 大連 116000)

紅鰭東方 鲀 (Takifugu rubripes), 隸屬于鲀形目(Telraodontiformes)、鲀科(Tetradontidae)、東方 鲀 屬(Takifugu), 是具有海江洄游習(xí)性的底棲魚類, 主要分布在黃海、渤海和東海。 紅 鰭東方 鲀 肉味鮮美, 營養(yǎng)豐富, 脂肪含量低, 含有豐富的多種有益微量元素,是經(jīng)濟(jì)價值較高的魚種之一(Aparicio et al, 2002;Asakawa et al, 2010)。近年來, 紅 鰭東方 鲀 在我國大連、秦皇島、唐山、天津等地區(qū)開始大量養(yǎng)殖, 已成為我國沿海河豚漁業(yè)的主要養(yǎng)殖種類, 隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大, 生長速度慢、產(chǎn)量低、發(fā)病率高等種質(zhì)退化現(xiàn)象不斷發(fā)生, 加之種質(zhì)不純正、養(yǎng)殖技術(shù)不規(guī)范等現(xiàn)象, 嚴(yán) 重制約了紅鰭東方 鲀 養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此,培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的紅鰭東方 鲀 新品種, 并進(jìn)行低毒養(yǎng)殖是我國河豚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需求。

對于動物的選擇育種, 育種基礎(chǔ)群體遺傳背景分析是育種工作的基礎(chǔ), 它可以評估遺傳育種的潛力, 決定著選擇育種所能取得的遺傳進(jìn)展, 甚至育種工作的成敗。動物育種基礎(chǔ)群體遺傳變異的研究目前主要利用分子生物學(xué)(徐成等, 2001; 全迎春等,2006; Chistiakovet al, 2009)和生物多元統(tǒng)計(馬愛軍等, 2008; 王新安等, 2008)的方法進(jìn)行。有關(guān)紅鰭東方 鲀 選育群體的遺傳變異已有利用分子生物學(xué)對其進(jìn)行研究(郝君等, 2006; 萬玉美等, 2011), 但通過生物多元統(tǒng)計的方法對其進(jìn)行研究尚未見有報道。目前, 本 課題組正在開展紅鰭東方 鲀 的良種選育研究, 也利用微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性研究分析了所收集選育群體的遺傳變異。本研究采用聚類分析、主成分分析和判別分析三種生物多元統(tǒng)計方法和單因子方差分析方法對紅鰭東方 鲀 三個選育群體的遺傳背景進(jìn)行分析, 以 期為紅鰭東方 鲀 良種選育工作提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料來源

本研究所用數(shù)據(jù)為 3 個不同群體的紅鰭東方鲀生長性能測定資料。其中, 大連天正實業(yè)有限公司人工養(yǎng)殖群體, 記為 R; 大連天正從日本引進(jìn)的群體,記為J; 大連天正在黃海捕撈的野生群體, 記為Y。不同群體的培育, 維持各項養(yǎng)殖管理條件基本一致。分別對3個群體進(jìn)行數(shù)據(jù)采集時, 為消除個體規(guī)格差異對實驗結(jié)果的影響, 所采用數(shù)據(jù)的大小規(guī)格應(yīng)盡量接近。觀察樣本的數(shù)量和規(guī)格見表1。

1.2 數(shù)據(jù)分析

1.2.1 性狀測量 實地隨機(jī)抽樣, 逐尾用游標(biāo)卡尺、直尺等測量工具測定 3個不同群體的形態(tài)學(xué)性狀。群體測量參數(shù)包括全長(TL)、體長(BL)、體高(BD)、頭長(HL)、眼后頭長(EH)、吻長(SL)、口寬(MW)、眼徑(ED)、眼間距(IS)、尾柄長(CPL)、尾柄高(CPD)、尾柄寬(CPB)、體寬(BW)、頭長+軀干長(HL+TR)、尾長(TA)、體周長 1(BG1)(沿背鰭前環(huán)軀干長度)、體周長2(BG2)(沿胸鰭后環(huán)軀干長度)等17個形態(tài)性狀(圖1), 精確到0.01cm。

表1 紅鰭東方鲀3個不同群體的觀測樣本數(shù)量和規(guī)格Tab.1 The numbers and sizes of samples from three different populations of T. rubripes

圖1 紅 鰭東方 鲀 形態(tài)學(xué)測量位點Fig.1 The morphological and mark points for measurement of T. rubripes

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 對于上述所得的形態(tài)學(xué)特征數(shù)據(jù)與其體長(BL)的比值作為形態(tài)度量分析的性狀值,以消除樣本個體大小差異對形特征的影響(王新安等,2008)。共得到 16個比例性狀, 采用統(tǒng)計軟件SPSS11.5進(jìn)行以下統(tǒng)計分析。

(1) 聚類分析 參照等Betal等(2004)、錢榮華等(2003)的方法, 利用軟件分析所得歐幾里德距離(Euclidean Distance)和相似系數(shù)(Coefficients)進(jìn)行群體聚類, 用樹形圖顯示群體間的親疏程度。

(2) 主成分分析 參照Moralev(2001)、蘇金明等(2002)的方法, 通過軟件分析, 從所有參數(shù)指標(biāo)中得出3個綜合性指標(biāo), 即3個主成分; 計算機(jī)軟件分析將輸出主成分1、主成分2和主成分3的貢獻(xiàn)率及三者累積貢獻(xiàn)率, 顯示各主成分的特征向量。

(3) 判別分析 采用逐步分析(Use stepwisemethod)的方法對所有參數(shù)進(jìn)行校正, 對所有的樣本進(jìn)行逐個判別。判別準(zhǔn)確率的計算公式:

判別準(zhǔn)確率P1=(判 斷正確的紅鰭東方 鲀 尾數(shù)/實際判別的該群體尾數(shù))×100%

判別準(zhǔn)確率P2=(判 別正確的紅鰭東方 鲀 尾數(shù)/判入該群體尾數(shù))×100%

式中,Ai為群體判別正確的七帶石斑魚數(shù),Bi為實測的群體樣本數(shù),K為群體數(shù)。

(4) 單因子方差分析 運(yùn)用 SPSS11.5軟件, 采用單因子方差分析(One-way ANOVA), 并采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較分析不同群體間的形態(tài)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚類分析

利用系統(tǒng)聚類分析, 日本群體(J)、野生群體(Y)和養(yǎng)殖群體(R)間的平均歐式距離見表 2, 聚類結(jié)果見圖2。從圖2可見: 日本群體(J)和養(yǎng)殖群體(R)先聚在一起, 與養(yǎng)殖群體(R)一起被歸為一類, 然后再與日本群體(J)聚在一起, 而日本群體(J)被歸為另外一類。這說明野生群體(Y)與養(yǎng)殖群體(R)的形態(tài)較為相似。從表 2可見: 野生群體(Y)和養(yǎng)殖群體(R)的歐式距離為 0.388839, 與日本群體(J)的歐式距離為0.536764, 養(yǎng)殖群體(R)和日本群體(J)間的歐式距離最大, 為0.711762。

表2 紅鰭東方鲀3個群體間的歐氏距離Tab.2 The Euclidean distance among three T. rubripes populations

圖2 3個不同群體的聚類分析樹形圖Fig.2 Hierarchical dendrogram of three different populations of T. rubripes

2.2 主成分分析

對紅鰭東方 鲀 3個群體的16個形態(tài)比例性狀進(jìn)行主成分分析, 共獲得3個主成分。16個性狀對3個主成分的特征向量及 3個主成分的方差貢獻(xiàn)率見表3。結(jié)果表明: 第一個主成分貢獻(xiàn)率為54.961%, 根據(jù)主成分特征向量分量的絕對值可知, 主要反映CPB/BL、CPD/BL、TA/BL、HL/BL、CPL/BL、BW/BL、MW/BL、BG2/BL、ED/BL和 TR/BL等指標(biāo), 其中CPB/BL、CPD/BL、TA/BL的影響最大; 第二個主成分貢獻(xiàn)率為 12.129%, 明顯比第一主成分低得多, 主要反映BD/BL、IS/BL和TL/BL等指標(biāo); 第三個主成分更低, 貢獻(xiàn)率僅為6.459%, 主要反映指標(biāo)EH/BL。三個主成分的累積貢獻(xiàn)率為 73.549%, 未達(dá)到累積貢獻(xiàn)率大于或等于 85%的要求, 說明難以用幾個相互獨立的因子來概括紅鰭東方 鲀 不同群體間的形態(tài)差異。

表3 紅鰭東方鲀3個群體的16個性狀對3個主成分的特征向量及主成分的貢獻(xiàn)率Tab.3 Eigenvectors and cumulative contribution rates of three principal components from the 16 traits of three T. rubripes populations

用紅鰭東方 鲀 3個不同群體的主成分1、主成分2和主成分3繪制三維空間主成分分析圖, 結(jié)果如圖3所示。主成分 1主要反映了 CPB/BL、CPD/BL、TA/BL、HL/BL、CPL/BL、BW/BL、MW/BL、BG2/BL、ED/BL和 TR/BL等指標(biāo), 主成分 2主要反映了BD/BL、IS/BL和TL/BL等指標(biāo), 而主成分3主要反映指標(biāo)EH/BL。從圖3中可以看出: 3個群體間的形態(tài)差異分化明顯, 形成三個不同的類群, 3群體在主成分1軸上的差異較在主成分2軸及主成分3軸上的差異明顯。圖中顯示, 野生群體(Y)和養(yǎng)殖群體(R)的形態(tài)差異較小, 與日本群體(J)的形態(tài)差異稍大, 養(yǎng)殖群體和日本群體(J)間的形態(tài)差異最大。

圖3 3 個群體紅鰭東方 鲀 主成分1、主成分2和主成分3的散布圖Fig.3 Scatter diagram for PC1, PC2, and PC3 of Plot of T.rubripes form three different populations

2.3 判別分析

利用逐步判別法, 對 16個形態(tài)比例參數(shù)進(jìn)行判別分析。結(jié)果表明, 除TA/BL和EH/BL兩個比例性狀外, 其余 14個比例性狀依次進(jìn)入判別公式, 此時,判別準(zhǔn)確率和綜合判別率均為100%。顯然, 包含14個比例性狀的判別公式對群體的判別是非常精確的,但同時工作量也很大, 理想的判別公式應(yīng)該既具有較高的判別率, 又具有很強(qiáng)的實用性。因此, 為了建立簡便實用的判別公式, 在確保一定判別準(zhǔn)確率的前提下, 進(jìn)一步篩選出貢獻(xiàn)較大的形態(tài)比例參數(shù), 并建立判別公式。從14個特征性狀中篩選出對區(qū)分三類群體有顯著貢獻(xiàn)的 6個變量, 即 IS/BL、TL/BL、BD/BL、ED/BL、BG2/BL和BW/BL進(jìn)行判別分析,F檢驗的結(jié)果表明, 這 6個性狀均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。根據(jù) 6 個參數(shù)所建立的3個群體的判別公式為:

日本群體(J):Y=－324.718+337.267X1+477.595X2+101.732X3－227.039X4+191.878X5－341.491X6

野生群體(Y):Y=－367.972+822.610X1+464.599X2+93.925X3+361.016X4+143.064X5－378.003X6

養(yǎng)殖群體(R):Y=－177.218+312.496X1+328.871X2－136.590X3+215.779X4+21.577X5+48.104X6

式中,X1、X2、X3、X4、X5和X6分別表示 IS/BL、TL/BL、BD/BL、ED/BL、BG2/BL和BW/BL。

為驗證判別公式的實用性, 對測量樣本按上述判別公式進(jìn)行預(yù)測分類, 見表 4。三個群體的判別準(zhǔn)確率P1依次為99.33%、97.69%和100%, 判別準(zhǔn)確率P2依次為 97.39%、100%和 97.44%, 綜合判別率為98.62%。F檢驗結(jié)果表明判別效果較好(P＜0.01), 因此, 群體的判別公式是可靠的。顯然, 對3個群體進(jìn)行判別時, 盡管包含6個比例性狀的判別公式比包含14個性狀的判別公式的準(zhǔn)確率稍有降低, 但各類判別率依然很高(＞97.36%), 同時工作量大大降低, 因此可在實際工作中進(jìn)行應(yīng)用。要 判斷某尾紅鰭東方鲀所歸屬的群體, 只需測出上述6個形態(tài)比例參數(shù), 分別代入上述3個判別公式, 計算出3個函數(shù)值, 以函數(shù)值最大的判別函數(shù)所對應(yīng)的群體名稱作為該個體的群體名。

表4 基于6個貢獻(xiàn)顯著的比率變量判別函數(shù)對3個群體判別分析結(jié)果Tab.4 Results of discriminant analysis of three populations of T. rubripes based on three discriminant functions with six significant ratio variables

2.4 單因子方差分析

對紅鰭東方 鲀 3個群體的16個形態(tài)比例性狀分別進(jìn)行單因子方差分析, 并對差異顯著者在兩兩群體間進(jìn)一步進(jìn)行多重比較分析, 分析結(jié)果見表 5。方差分析結(jié)果表明: 在群體間所比較的 16個形態(tài)比例性狀值中, 除比例性狀 MW/BL差異不顯著(P＞0.05)外, 其余均達(dá)到顯著(P＜0.05)或極顯著水平(P＜0.01)。兩兩比較結(jié)果表明: 養(yǎng)殖群體(R)和日本群體(J)之間差異顯著的有15項, 其中12項達(dá)到極顯著水平; 養(yǎng)殖群體(R)和野生群體(Y)之間差異顯著的有 8項, 其中6項達(dá)到極顯著水平; 日本群體(J)和日野生群體(Y)之間差異顯著的有13項, 其中9項達(dá)到極顯著水平。

表5 3個群體16個比例性狀的平均值Tab.5 Means of the 16 morphometric traits in three populations

3 討論與結(jié)論

目前, 動物群體差異分析主要有分子生物學(xué)(徐成等, 2001; 全迎春等, 2006; Chistiakovet al, 2009)和生物多元統(tǒng)計(馬愛軍等, 2008; 王新安等, 2008)兩種方法。由于實驗材料易得, 操作簡便, 生物多元統(tǒng)計方法近年來得到廣泛應(yīng)用(錢榮華等, 2003; 馬愛軍等,2008; 王新安等, 2008; 李義軍等, 2010; 董志國等,2010)。具體來說, 多元統(tǒng)計就是研究客觀事物中多個變量(或多個因素)之間相互依賴的統(tǒng)計規(guī)律性, 它的重要基礎(chǔ)之一是多元正態(tài)分析, 又稱多元分析。近年來, 隨著統(tǒng)計理論研究的不斷深入, 多元統(tǒng)計分析方法的內(nèi)容一直在豐富。其中, 主要內(nèi)容包括多元正態(tài)總體參數(shù)估計、假設(shè)檢驗和常用的多元統(tǒng)計方法。多元正態(tài)總體參數(shù)估計、假設(shè)檢驗是多元統(tǒng)計推斷的核心和基礎(chǔ), 而常用的多元統(tǒng)計分析方法則是具體應(yīng)用。從形式上, 常用多元統(tǒng)計分析方法可劃分為兩類:一類屬于單變量常用的統(tǒng)計方法在多元隨機(jī)變量情況下的推廣和應(yīng)用, 如多元回歸分析、典型相關(guān)分析等; 另一類是對多元變量本身進(jìn)行研究所形成的一些特殊方法, 如主成分分析、因子分析、聚類分析、判別分析、對應(yīng)分析等。在動物領(lǐng)域, 通常利用主成分分析、聚類分析和判別分析對群體差異進(jìn)行綜合判定(錢榮華等, 2003; 馬愛軍等, 2008; 王新安等, 2008;李義軍等, 2010; 董志國等, 2010)。

本文利用聚類分析、主成分分析和判別分析三種常用的生物多元統(tǒng)計方法以及單因子方差分析的方法對3 個不同群體紅鰭東方 鲀 的形態(tài)差異進(jìn)行了研究。聚類分析是對不同群體進(jìn)行初步歸類, 量化群體間的差異程度, 常被用來對分析對象的相似程度進(jìn)行分析(蔡慶華, 1990; 李勤生等, 1991)。本研究中,從聚類分析樹形圖和群體間的歐式距離可以看出, 3個不同群體的紅鰭東方 鲀 群體間, 日本群體(J)和養(yǎng)殖群體(R)的差異最大, 野生群體(Y)和養(yǎng)殖群體(R)的差異最小, 野生群體(Y)和日本群體(J)的差異處于中間位置。主成分分析是一種將原來多個彼此相關(guān)的指標(biāo)轉(zhuǎn)換為新的、個數(shù)較少且相互獨立或不相關(guān)綜合指標(biāo)的方法, 可以化簡為繁, 且不損失或很少損失原有信息, 在體型分析中已得到廣泛應(yīng)用(錢榮華等,2003; 魏開建等, 2003)。將多個形態(tài)比例性狀綜合成少數(shù)幾個因子, 從而得出不同群體的差異大小, 并可根據(jù)不同群體的主成分值找出各群體在各主成分值上差異較大的參數(shù)(錢榮華等, 2003; 韓冰等, 2007)。在本研究中, 從主成分分析圖上可以看出, 3個不同群體的紅鰭東方 鲀 群體, 形態(tài)差異分化明顯, 形成三個不同的類群, 野生群體(Y)和養(yǎng)殖群體(R)的形態(tài)偏離較小, 與日本群體(J)的形態(tài)偏離稍大, 養(yǎng)殖群體(R)和日本群體(J)間的形態(tài)偏離最大。這與聚類分析的結(jié)果相同。判別分析是鑒定魚類群體的常用方法之一,用構(gòu)建的判別公式可以較準(zhǔn)確地進(jìn)行群體的判別(練青平等, 2011)。在本研究的判別分析中, 利用貢獻(xiàn)率最大的 6 個參數(shù) IS/BL、TL/BL、BD/BL、ED/BL、BG2/BL和BW/BL構(gòu)建了3個判別函數(shù), 對3 種魚樣本的綜合判別準(zhǔn)確率為98.62%, 錯判率僅為1.38%。顯然, 本函數(shù)的判別效果較好。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn), 進(jìn)入判別函數(shù)的貢獻(xiàn)率最大的3個參數(shù)IS/BL、TL/BL、BD/BL是主成分分析中主成分2所反映的指標(biāo), 另3個貢獻(xiàn)率大的參數(shù)ED/BL、BG2/BL和BW/BL是主成分1 所反映的指標(biāo)。對紅鰭東方 鲀 3個群體的16個形態(tài)比例性狀方差分析多重比較的結(jié)果表明, 養(yǎng)殖群體(R)和日本群體(J)之間差異顯著的有15項, 其中12項達(dá)到極顯著水平; 養(yǎng)殖群體(R)和野生群體(Y)之間差異顯著的有 8項, 其中 6項達(dá)到極顯著水平;日本群體(J)和野生群體(Y)之間差異顯著的有 13項,其中9項達(dá)到極顯著水平, 顯然, 從方差分析的結(jié)果可以看出, 養(yǎng)殖群體(R)和日本群體(J)之間差異最大,養(yǎng)殖群體(R)和野生群體(Y)之間差異最小。綜合3種生物多元統(tǒng)計分析和方差分析的結(jié)果可以看出, 方差分析與聚類分析、主成分分析和判別分析的結(jié)論基本上是類似的, 但也存在稍許差異, 它們從不同的角度反映了群體間的形態(tài)學(xué)差異, 其作用是不可相互替代的。

事實上, 基于生物多元統(tǒng)計的方法對動物群體差異進(jìn)行研究, 想要得到精確的結(jié)果并非一項容易的工作。這主要是由于動物群體尺寸規(guī)格的差異會使研究結(jié)論失真, 出現(xiàn)“假分離”現(xiàn)象。為消除群體大小差異對研究結(jié)果的影響, 通常情況下, 采用所采集的形態(tài)特征數(shù)據(jù)與其體長的比值作為形態(tài)度量分析的性狀值, 本文也對分析數(shù)據(jù)進(jìn)行了這種處理。然而,這種轉(zhuǎn)換方法也只是在一定程度上減弱了群體差異對研究結(jié)果的影響, 因為即使是對相同的動物群體,在不同發(fā)育階段的表型形態(tài)的比值范圍也是不同的。因此, 利用生物多元統(tǒng)計研究不同動物群體差異的良好方法, 是在盡量縮小不同群體大小規(guī)格差異的前提下, 同時采用生物多元統(tǒng)計和分子生物學(xué)的方法對相同的研究對象進(jìn)行研究, 即: 分子生物學(xué)的研究材料來源于生物多元統(tǒng)計的研究個體, 對兩種研究結(jié)論綜合分析, 得出較為準(zhǔn)確的結(jié)論。

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