徐金濤 龐 敏 馬 新 毛雪薇 吳振興 陳洪舉王 燕 張學(xué)雷

(1. 國(guó)家海洋局秦皇島海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站 秦皇島 066002; 2. 國(guó)家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心 青島266061; 3. 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 青島 266100; 4. 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心 青島 266002)

海洋作為全球最大的碳庫(kù), 能不斷吸收大氣中持續(xù)升高的 CO2, 從而導(dǎo)致海水 pH 值下降(酸度增加), 該過(guò)程即海洋酸化(石莉等, 2011)。海洋酸化導(dǎo)致海水碳酸鹽系統(tǒng)發(fā)生變化, 直接影響依賴于海水化學(xué)環(huán)境的海洋生物, 從而威脅整個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)和海洋經(jīng)濟(jì)(唐啟升等, 2013)。近年來(lái), 赤潮頻頻暴發(fā),其中有毒有害赤潮所占比例也逐年增長(zhǎng)(中國(guó)海洋災(zāi)害公報(bào) 1999—2013), 海洋酸化的加劇與赤潮密切相關(guān)(Chen et al, 2014), 而有毒赤潮藻類能否出現(xiàn)光合作用的相關(guān)響應(yīng)、能否改變其毒素組成以適應(yīng)海洋酸化的加劇均已成為海洋生態(tài)學(xué)家新的關(guān)注點(diǎn)(Falkowski, 2012; Scarlett et al, 2013)。

塔瑪亞歷山大藻是我國(guó)近海常見(jiàn)有毒赤潮藻種,自北向南均有分布, 并曾引發(fā)過(guò)赤潮(郭皓, 2004)。它是主要進(jìn)行光合自養(yǎng)的甲藻(Cabrerizo et al, 2014),并能產(chǎn)生麻痹性貝毒(paralytic shellfish toxins, PSTs)積累在濾食性的雙殼貝類體內(nèi), 威脅消費(fèi)者健康(Asakawa et al, 2005)。近年來(lái), 國(guó)內(nèi)外在塔瑪亞歷山大藻的形態(tài)結(jié)構(gòu)與分類(齊雨藻等, 1994)、生長(zhǎng)環(huán)境影響因素(顏天等, 2002)、種間競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制(由希華等,2006)、分子生物學(xué)鑒定(Destombe et al, 1992)等方面開(kāi)展研究并取得重要進(jìn)展。研究表明, CO2是塔瑪亞歷山大藻光合作用的主要底物和所產(chǎn)PSTs中嘌呤環(huán)及R4基團(tuán)上C的主要來(lái)源, 海洋環(huán)境中CO2濃度的升高對(duì)非鈣化的塔瑪亞歷山大藻生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用(Eberlein et al, 2014)。目前通過(guò)模擬大氣中CO2濃度升高, 采用活體葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)技術(shù)(pulseamplitude-modulation, PAM), 根據(jù)葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化來(lái)研究該藻種光合作用的響應(yīng), 以及采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)技術(shù)分析其產(chǎn)毒特征均尚未見(jiàn)報(bào)道。

本文選用自養(yǎng)有毒甲藻——塔瑪亞歷山大藻為研究對(duì)象, 模擬大氣中 CO2濃度升高, 采用 PAM 技術(shù)檢測(cè)葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的變化, 以分析環(huán)境中 CO2加富對(duì)塔瑪亞歷山大藻光合作用的影響, 同時(shí)采用 HPLC技術(shù)分析 CO2加富條件下塔瑪亞歷山大藻所產(chǎn)毒素, 以期為研究海洋浮游微藻對(duì)海洋酸化的響應(yīng)提供基礎(chǔ)資料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種及其培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)用塔瑪亞歷山大藻種來(lái)自國(guó)家海洋局第一海洋研究所種質(zhì)室。海水取自青島近岸, 0.45μm醋酸纖維膜過(guò)濾, 高溫高壓(121°C, 1.2×105Pa)滅菌后, 冷卻至室溫; 培養(yǎng)液選用 f/2營(yíng)養(yǎng)鹽配方。藻懸液置于國(guó)家海洋局第一海洋研究所人工氣候培養(yǎng)室培養(yǎng),溫度(20±1)°C, 光照強(qiáng)度 120μmol/ (m2·s), 光周期12:12, pH為8.0±0.1, 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期接種。

1.2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的設(shè)定

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液接種到裝有 1500mL海水的2L三角燒瓶中, 采用一次性培養(yǎng)的方法, 實(shí)驗(yàn)組(加富組)通含 1000×10–6CO2(IPCC預(yù)計(jì)本世紀(jì)末達(dá)到的大氣CO2濃度)(石莉等, 2011)的過(guò)濾空氣; 對(duì)照組通含 370×10–6CO2的過(guò)濾空氣, 通氣玻璃管距液面一定距離, 氣體流量控制在300mL/min。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。每隔2天于下午14:00進(jìn)行取樣, 進(jìn)行各參數(shù)的測(cè)定, 共取樣10次。

1.3 細(xì)胞密度、葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

葉綠素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)采用脈沖-振幅-調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(Phyto-PAM, ED, Walz, Effeltrich,Germany)進(jìn)行測(cè)定。取經(jīng)過(guò)20min暗適應(yīng)的藻液3mL于測(cè)量皿中, 打開(kāi)調(diào)制測(cè)量光, 待讀數(shù)穩(wěn)定時(shí), 打開(kāi)飽和脈沖, 可測(cè)得光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)最大葉綠素?zé)晒釬m和初始最小葉綠素?zé)晒?F0, 此時(shí)的 Y即為 Fv/Fm,其中 Fv= Fm–F0。F0的弱檢測(cè)光強(qiáng)為 1μmol/ (m2·s), Fm的脈沖飽和光強(qiáng)為 1064μmol/(m2·s), 持續(xù) 20ms, 每組樣品測(cè)定3次。

利用調(diào)制葉綠素?zé)晒饧夹g(shù), 在每一光合有效輻射(PAR)強(qiáng)度下適應(yīng)很短的時(shí)間, 得出的典型光響應(yīng)曲線稱為快速光曲線(Rapid Light Curve, RLC)。RLC測(cè)定時(shí), 設(shè)定的光強(qiáng)梯度為16、32、64、264、464、664、864、1064、1264、1464μmol/(m2·s), 光適應(yīng)時(shí)間為 10s, 測(cè)量結(jié)束后, 利用儀器自帶的Eilers-Peeters模型進(jìn)行擬合, 擬合后得到rETRmax、α、Ik三個(gè)光合作用過(guò)程中的重要參數(shù)。rETRmax相當(dāng)于最大光合速率Pm、α反映對(duì)光的利用效率(捕光能力),Ik反映了樣品對(duì)強(qiáng)光的耐受能力。

1.4 毒素的收集與測(cè)定

塔瑪亞歷山大藻是典型的產(chǎn) PSTs藻株, 毒素的收集與測(cè)定方法參照文獻(xiàn)(陳建華, 2013)。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在第19天取樣完成后剩余的每瓶藻液分別過(guò)濾到玻璃纖維膜(GF/C, Φ0=47mm, 0.45μm)上, 隨即將濾膜剪碎, 放入離心管中, 加入3mL HAc(0.05M)溶液, 在冰浴中用超聲波破碎儀(功率 200W, 處置20s后靜置 40s, 重復(fù) 5次)擊碎藻細(xì)胞; 靜置提取10min后 6976g離心 5min, 吸取上清液用水性濾頭(ANPEL, SCAA-102, 13mm, 0.22μm)過(guò)濾至樣品瓶中,用于毒素的液相色譜儀分析。分析中使用的毒素標(biāo)準(zhǔn)(GTX1-4, dcGTX2、3, GTX5, C1、2, STX, NEO, dcSTX,dcNEO)均購(gòu)自加拿大國(guó)家海洋生物研究所(National Research Council, NRC), 檢測(cè)方法參照 Diener等(2006)所建立的梯度洗脫方法進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用SPSS for windows 16.0和Origin8.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn), 然后采用配對(duì)數(shù)據(jù)T檢驗(yàn)(Paried T-Test)分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異顯著性, 再采用 One-Way ANOVA分析培養(yǎng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組熒光參數(shù)Fv/Fm、rETRmax、α、Ik是否具有顯著影響。上述統(tǒng)計(jì)分析差異的置信度水平設(shè)為 0.05(顯著)和 0.01(極顯著)。

2 結(jié)果

2.1 CO2加富對(duì)塔瑪亞歷山大藻PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm的影響

如圖 1, 在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi), 實(shí)驗(yàn)組的 Fv/Fm均顯著高于對(duì)照組(除第 17天外)。結(jié)果說(shuō)明, CO2加富對(duì)Fv/Fm具有極顯著影響(P＜0.01), 能促進(jìn)塔瑪亞歷山大藻 PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量, 提高其最大光能轉(zhuǎn)換效率, 在后期CO2加富會(huì)起到抑制作用。

此外, 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組 Fv/Fm均有顯著影響(P＜0.05), 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的 Fv/Fm均隨著培養(yǎng)時(shí)間而降低, 對(duì)照組的變化范圍是 0.51—0.60, 實(shí)驗(yàn)組的變化范圍是0.52—0.65。這說(shuō)明隨著培養(yǎng)時(shí)間PSII的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量會(huì)降低。同時(shí), Fv/Fm還是藻類生理狀態(tài)的重要指標(biāo), 對(duì)甲藻而言, 未受生理脅迫的Fv/Fm一般穩(wěn)定在0.65左右(Kolber et al, 1988)。因此, 此結(jié)果還說(shuō)明隨著作用時(shí)間的增長(zhǎng), 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的塔瑪亞歷山大藻均受到一定程度的抑制。

圖1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的Fv/Fm隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.1 Variation in Fv/Fm of the experimental and control group vs. culturing time

2.2 CO2加富對(duì)快速光曲線的影響

如圖 2a, 實(shí)驗(yàn)組 rETRmax前 13天顯著高于對(duì)照組(P＜0.05), 第 15、17天開(kāi)始顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)果說(shuō)明, CO2加富對(duì)rETRmax有顯著影響(P＜0.05), 在培養(yǎng)前期, CO2加富能促進(jìn)塔瑪亞歷山大藻的相對(duì)最大電子傳遞效率(即最大光合速率), 培養(yǎng)15天后, CO2加富卻抑制塔瑪亞歷山大藻的相對(duì)最大電子傳遞效率; 然而對(duì) Ik和 α影響不顯著(P＞0.05),說(shuō)明 CO2加富對(duì)塔瑪亞歷山大藻的光能利用效率及耐受強(qiáng)光的能力影響不顯著(如圖2b、c)。

對(duì)于任一組, 培養(yǎng)時(shí)間對(duì) rETRmax、Ik均有顯著影響(P＜0.05), 而對(duì)α沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)。隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng), 實(shí)驗(yàn)組的 rETRmax均先下降后上升, 最后保持穩(wěn)定, 變化范圍是 257.6—434.8, 對(duì)照組的rETRmax則保持穩(wěn)定, 變化范圍是219.5—317.7; 實(shí)驗(yàn)組的 Ik均隨呈下降趨勢(shì), 變化范圍是 1119.7—1661,對(duì)照組的Ik均逐漸上升, 變化范圍是961.5—1492.5。結(jié)果說(shuō)明, 塔瑪亞歷山大藻的最大光合速率在 CO2未加富時(shí)基本保持穩(wěn)定, 而在 CO2加富時(shí)則呈現(xiàn)隨培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)而下降趨勢(shì); 耐受強(qiáng)光的能力在 CO2未加富時(shí)呈上升趨勢(shì), 在CO2加富時(shí)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.3 CO2加富對(duì)塔瑪亞歷山大藻產(chǎn)毒的影響

圖2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的快速光曲線擬合參數(shù)rETRmax、Ik、α隨培養(yǎng)時(shí)間的變化Fig.2 Variations of rETRmax, Ik, and α of the experimental and control group vs. culturing time

圖3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的PSTs含量比較Fig.3 Concentration of PSTs component extracted from the experimental and control group

如圖3所示, 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均檢出PSTs毒素,其中占優(yōu)勢(shì)的是GTX1、GTX4、C1及C2毒素, 實(shí)驗(yàn)組GTX1、GTX4、C1及C2毒素分別占毒素總量的10.5%、3.7%、77.3%、7.0%, 對(duì)照組GTX1、GTX4、C1及 C2毒素則分別占毒素總量的 4.0%、3.4%、81.6%、7.5%, 毒素C1含量均遠(yuǎn)超過(guò)該組內(nèi)其余三種毒素含量; 毒素 GTX1、GTX4的含量實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組, 毒素C1、C2的含量對(duì)照組顯著高于實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。結(jié)果說(shuō)明, 本實(shí)驗(yàn)所選用塔瑪亞歷山大藻株主要是產(chǎn)氨基甲酸酯類和 N-磺酰氨甲酰基類兩類毒素, 并且 N-磺酰氨甲?；惗舅卣冀^對(duì)優(yōu)勢(shì);CO2加富促使氨基甲酸酯類毒素產(chǎn)量提高, 而導(dǎo)致N-磺酰氨甲?；惗舅禺a(chǎn)量下降。

3 討論

甲藻是浮游藻類的重要成員, 對(duì)環(huán)境因子的變化極為敏感。為了適應(yīng)環(huán)境CO2濃度的升高, 有毒甲藻生長(zhǎng)及產(chǎn)毒特征也將發(fā)生一系列響應(yīng)性的變化。

本研究發(fā)現(xiàn), CO2加富能促進(jìn)塔瑪亞歷山大藻PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(圖 1)和最大相對(duì)電子傳遞效率(圖2), 這可能是由于CO2作為光合作用的底物,在 CO2加富條件下塔瑪亞歷山大藻啟動(dòng)了自身 CO2濃縮機(jī)制(CO2concentrating mechanisms, CCMs)提高了 1,5—二磷酸核酮糖羧化酶(RuBP)的活性, 增強(qiáng)了CO2的固定能力, 而 RuBP加氧酶的活性受到抑制,降低了光呼吸, 同時(shí) CO2加富能相對(duì)提高光系統(tǒng)上蛋白的活性及其合成效率, 從而提高光合作用活性(張道允等, 2007)。此外, 塔瑪亞歷山大藻自身也會(huì)有一定的適應(yīng)機(jī)制, 在 CO2底物濃度提高而光照強(qiáng)度不變的條件下, 塔瑪亞歷山大藻通過(guò)提高對(duì)光能的利用效率(初始斜率 α), 和耐受強(qiáng)光的能力(半飽和光強(qiáng)Ik), 來(lái)提高光合速率(Cabrerizo et al, 2014)。

光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的最大光化學(xué)量子產(chǎn)率 Fv/Fm反映了藻類進(jìn)行光合作用的最大潛力, 同時(shí)也是反映藻類生理狀況的重要指標(biāo)。已有研究表明, 當(dāng)微藻受到光照、溫度、鹽度、營(yíng)養(yǎng)鹽等環(huán)境因子脅迫時(shí), Fv/Fm顯著降低(梁英等, 2007)。在本研究中, 隨著培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的 Fv/Fm均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì), 這與前人的研究結(jié)果(梁英等, 2007; Napoléon et al,2013)是一致的。Ik反映藻類耐受強(qiáng)光的能力, 在RLC中為Pm與α之比, 本研究中CO2加富對(duì)Ik影響不顯著但耐受強(qiáng)光能力表現(xiàn)出隨培養(yǎng)時(shí)間減弱的趨勢(shì),這可能是由于 PSⅡ積累過(guò)剩的光能而破壞反應(yīng)中心(Sage et al, 1989), 并與丁柳麗等(2014)對(duì)大型綠藻石莼(Ulva lactica)的研究一致。

葉綠素 a是海洋浮游植物中除藍(lán)藻以外均含有的特征色素, 一般用其含量來(lái)表示浮游植物的生物量, 本研究中利用 Photo-PAM 在一定的調(diào)制頻率下測(cè)定活體葉綠素?zé)晒庵? 通過(guò)與Fv/Fm、rETRmax、Ik、α相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), 對(duì)照組chl a含量與Fv/Fm呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(如圖4a), 與rETRmax、Ik、α相關(guān)性不顯著(圖未列出), 實(shí)驗(yàn)組 chl a含量與Fv/Fm、rETRmax、Ik、α呈現(xiàn)(極)顯著負(fù)相關(guān)(如圖 4b—e), 這說(shuō)明隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng), 藻類生長(zhǎng)從對(duì)數(shù)期逐漸進(jìn)入平臺(tái)期, 由于生長(zhǎng)空間和營(yíng)養(yǎng)條件的限制, 塔瑪亞歷山大藻的生長(zhǎng)逐漸受到環(huán)境脅迫, CO2的加富效應(yīng)不再明顯,最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm等葉綠素?zé)晒鈪?shù)均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。

此外, PSTs毒素是含有兩個(gè)胍基的三環(huán)化合物(圖5), 碳元素是其結(jié)構(gòu)中不可缺少的部分(于仁誠(chéng)等,1998 ), CO2的加富必將對(duì)其產(chǎn)量造成影響。根據(jù)基團(tuán)相似性可將 PSTs毒素分為五類: 一是氨基甲酸酯類毒素, 包括石房蛤毒素(saxitoxin, STX)、新石房蛤毒素(n e o s a x i t o x i n, N E O)、漆溝藻毒素 1-4(gongautoxin1-4,GTX1-4); 二是N-磺酰氨甲酰基類毒素, 包括石房蛤毒素5、6(GTX5、6)、N-磺酰氨甲?；舅?1-4(C1-4); 三是脫氨甲?；惗舅? 包括脫氨甲酰基石房蛤毒素(Decarbamoyl saxitoxin,dcSTX)、脫氨甲?；率扛蚨舅?Decarbamoyl neosaxitoxin, dcNEO)、脫氨甲?；釡显宥舅?-4(Decarbamoyl gongautoxin1-4, dcGTX1-4); 四是脫氧脫氨甲?；惗舅? 包括脫氧脫氨甲?；扛蚨舅?Deoxydecarbamoyl saxitoxin, doSTX)、脫氧脫氨甲?；釡显宥舅?2、3(Deoxydecarbamoyl gongautoxin2、3, doGTX2、3); 五是N-羥基類衍生物, 包括 N-羥基石房蛤毒素(N-hydroxycarbamoyl saxitoxin,HySTX)、N-羥基新石房蛤毒素(N-hydroxycarbamoyl neossaxitoxin, HyNeo)。不同地域生長(zhǎng)的塔瑪亞歷山大藻株產(chǎn)生的PSTs種類差異很大(Anderson et al, 1996; 林燕棠等, 1999), 在本研究所用塔瑪亞歷山大藻主要分離自渤海, 所產(chǎn)毒素主要由GTX1、GTX4、C1及C2毒素組成, 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中其總和均超過(guò)97%, 其中C1占絕對(duì)優(yōu)勢(shì), CO2加富并未改變毒素C1含量的優(yōu)勢(shì)地位,但是 CO2加富促使氨基甲酸酯類毒素(GTX1、GTX4)產(chǎn)量提高, 而導(dǎo)致N-磺酰氨甲?；惗舅?C1、C2)產(chǎn)量下降。這可能是由于CO2加富導(dǎo)致藻細(xì)胞N-磺酰氨甲酰基類毒素(C1、C2)向氨基甲酸酯類毒素(GTX1、GTX4)轉(zhuǎn)化, 從而對(duì)其整體毒性造成影響, 但由于塔瑪亞歷山大藻產(chǎn)毒還受到諸如營(yíng)養(yǎng)鹽、溫度、鹽度等多種環(huán)境因子的影響, CO2加富的影響還需進(jìn)一步探討。

圖4 對(duì)照組chl a與Fv/Fm及實(shí)驗(yàn)組chl a與Fv/Fm、rETRmax、Ik、α相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between chlorophyll a and Fv/Fm in the control group and between chlorophyll a and Fv/Fm , rETRmax, Ik or α in the experimental group

圖5 麻痹性貝毒的結(jié)構(gòu)式(Baden,1983)Fig.5 The structure of paralytic shellfish poisoning (Baden, 1983)

4 結(jié)論

塔瑪亞歷山大藻作為有毒赤潮甲藻的典型成員,在特定環(huán)境條件下, 其葉綠素?zé)晒鈪?shù)及產(chǎn)毒均對(duì)CO2加富會(huì)作出響應(yīng), 具體表現(xiàn)在能提高其最大光能轉(zhuǎn)換效率、相對(duì)最大電子傳遞效率以及促使產(chǎn)毒素發(fā)生轉(zhuǎn)化, 能為研究海洋浮游微藻對(duì)海洋酸化的響應(yīng)提供基礎(chǔ)資料和依據(jù)。

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