馮　潔，謝建云，馮麗萍，魏曉鋒，高　誠

(上海實驗動物研究中心，上海市實驗動物質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，上海　201203)

培養(yǎng)法和PCR法用于實驗大、小鼠細菌檢測的比較分析

馮潔，謝建云，馮麗萍，魏曉鋒，高誠

(上海實驗動物研究中心，上海市實驗動物質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，上海201203)

【摘要】目的比較培養(yǎng)法和PCR法對實驗大、小鼠的細菌檢測效果。方法分別采用傳統(tǒng)細菌分離培養(yǎng)結(jié)合生化鑒定方法和PCR方法，對78只SPF級大鼠和422只SPF級小鼠進行檢測，對兩種方法的檢測結(jié)果進行比較分析。結(jié)果78只SPF級大鼠均未檢測出陽性。422只SPF級小鼠，培養(yǎng)法檢測陽性率7.11%(30/422)，其中金黃色葡萄球菌10只，綠膿桿菌22只，肺炎克雷伯桿菌2只。PCR法檢測陽性率7.58%(32/422)，其中金黃色葡萄球菌10只，綠膿桿菌25只，肺炎克雷伯桿菌2只。結(jié)論PCR法的敏感性高于培養(yǎng)法，操作簡便、快捷，適用于實驗動物細菌的快速診斷和大規(guī)模的質(zhì)量篩查。

【關(guān)鍵詞】培養(yǎng)法；PCR法；實驗動物；細菌

金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌這3種細菌均屬于條件性致病菌，廣泛分布于自然界，正常情況下不會導(dǎo)致人和動物的臨床癥狀和疾病發(fā)生，但在免疫功能低下、定居部位改變或失調(diào)等特定情況下可引起機體的感染。這類細菌主要通過接觸和空氣傳播，以潛伏感染為主，對于免疫系統(tǒng)受損的宿主，常表現(xiàn)為感染、炎癥甚至死亡[1-3]，對實驗動物質(zhì)量以及實驗結(jié)果均造成影響。我國實驗動物微生物等級及監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)GB/T14922.2-2011明確規(guī)定，無特定病原體級(specific pathogen free，SPF)實驗大、小鼠必須檢測和排除上述3個項目。近年來文獻報道關(guān)于實驗動物金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等條件性致病菌的陽性率屢見不鮮[4-6]。國標(biāo)推薦的檢測方法為經(jīng)典的分離培養(yǎng)法，也是微生物診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但鑒于培養(yǎng)法存在耗時費力、操作繁瑣、結(jié)果受檢測人員主觀判定干擾較大等多方面原因，本實驗室嘗試建立金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌3重PCR檢測方法，并與國標(biāo)推薦的分離培養(yǎng)法進行比對，以探索PCR方法作為實驗動物細菌快速檢測方法的可行性。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動物：所有檢測的實驗大鼠、小鼠均為SPF級，來自上海10家實驗動物生產(chǎn)單位。

1.1.2菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 6538、綠膿桿菌ATCC 27853購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，肺炎克雷伯桿菌CMCC 46117購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3主要試劑：血瓊脂平皿、營養(yǎng)肉湯、NAC培養(yǎng)基、革蘭氏染液、細菌生化鑒定管、瓊脂粉均購自上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司，高鹽甘露醇平皿、DHL平皿均購自上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司。

細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，Taq DNA聚合酶、PCR buffer、Mg2+、2× Taq Plus Master Mix(Dye Plus)、DL2000 plus DNA marker均購自南京諾唯贊生物科技有限公司，瓊脂糖購自西班牙Bio-West公司，GoldViewTM核酸染料購自上海賽百盛(SBS)基因技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)法檢測：按國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14926-2001《實驗動物 微生物學(xué)檢測方法(1)(2)》進行金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌的常規(guī)分離培養(yǎng)、鑒定。無菌采集動物回盲部內(nèi)容物，分別接種至高鹽甘露醇平皿、NAC增菌液和DHL平皿，36℃培養(yǎng)(24～48)h，觀察培養(yǎng)結(jié)果。若有可疑樣品則按國標(biāo)實驗步驟繼續(xù)進行下一步純化和鑒定工作。

1.2.2DNA提?。喝∩鲜龌孛げ績?nèi)容物0.2 g，懸浮于1 mL的PBS(pH 7.4)中，850 r/min離心5 min后取上清液，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書嚴格操作，提取DNA模板，用于PCR檢測。獲得DNA樣品于-20℃ 保存。

1.2.3PCR法檢測：采用本單位已建立好的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌3重PCR方法對樣品進行檢測[7-9]。引物序列見表1。

PCR反應(yīng)體系50 μL，包括2× Taq Plus Master Mix (Dye Plus) 25 μL，其中Mg2+終濃度為2.5 mmol/L，dNTP終濃度為200 μmol/L，引物各0.2 μmol/L。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min后，按95℃ 變性30 s，57℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s的程序循環(huán)34次，最后72℃ 延伸10 min。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。PCR陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司，經(jīng)凝膠電泳純化回收后進行測序，測序結(jié)果與GenBank中已知核酸序列進行BLAST。

2結(jié)果

2.1培養(yǎng)法檢測結(jié)果

采用培養(yǎng)法對422只SPF級小鼠、78只SPF級大鼠進行檢測，共檢出30只陽性動物(7.11%)，均為小鼠。其中檢出金黃色葡萄球菌10只，綠膿桿菌22只，肺炎克雷伯桿菌2只。 其中有4只動物檢測結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌均為陽性。

2.2PCR法檢測結(jié)果

對上述動物同時進行金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌3重PCR檢測，共檢出32只陽性動物(7.58%)，均為小鼠。其中檢出金黃色葡萄球菌10只，綠膿桿菌25只，肺炎克雷伯桿菌2只。對陽性樣品進行測序后，與GenBank發(fā)表的序列進行比對，同源性均可達98%以上。其中有5只動物金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌均為陽性。

2.3培養(yǎng)法與PCR法檢測結(jié)果比較

被檢動物的品系和檢測結(jié)果詳情見表2。培養(yǎng)法檢測出陽性樣品30只，PCR法檢測出陽性樣品32只。培養(yǎng)法分別檢測金黃色葡萄球菌10只、綠膿桿菌22只、肺炎克雷伯桿菌2只；PCR方法分別檢測金黃色葡萄球菌10只、綠膿桿菌25只、肺炎克雷伯桿菌2只。其中有1例金黃色葡萄球菌和3例綠膿桿菌經(jīng)培養(yǎng)法檢測為陰性，但PCR檢測為陽性。有1例經(jīng)培養(yǎng)法檢測金黃色葡萄球菌為陽性，但PCR法未能檢出。

表1　PCR引物列表

表2　被檢動物品系及檢測結(jié)果統(tǒng)計

3討論

實驗動物細菌質(zhì)量控制是評價動物質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)之一。細菌感染對實驗動物本身的生長發(fā)育、實驗動物的生產(chǎn)使用、科學(xué)研究的結(jié)果以及從業(yè)人員和環(huán)境均能造成不同程度的影響。因此，開發(fā)新型檢測手段無論從實驗動物質(zhì)量控制還是從生物安全的角度都顯得尤為必要。

目前細菌檢測的方法一般包括分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測抗體、抗原以及核酸檢測方法等[10,11]。細菌分離培養(yǎng)被認為是金標(biāo)準(zhǔn)，也是最為常用的方法。我國實驗動物國標(biāo)推薦的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌檢測，采用的就是分離培養(yǎng)法。該方法根據(jù)細菌生物學(xué)特性、表型特征進行鑒定，經(jīng)典、準(zhǔn)確，但存在操作繁瑣、實驗周期長、效率較低等缺陷，受檢測試劑、檢測程序、軟硬件等多因素限制，易造成檢測結(jié)果的偏離。分子生物學(xué)技術(shù)則是針對細菌的特異性DNA進行檢測，因具有敏感、快速、簡便等優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用，我國實驗動物科研工作者已陸續(xù)開發(fā)了多種病原體的分子生物學(xué)檢測技術(shù)[12,13]。多重PCR是以普通PCR為基礎(chǔ)，同時加入多對引物，同時擴增多個目的基因，從而達到快速高效的一種新型手段[14-16]。但PCR方法也存在易污染、易出現(xiàn)假陽性、產(chǎn)物需經(jīng)測序驗證等缺點，實際應(yīng)用中應(yīng)加以規(guī)避。

本研究針對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌同時開展了培養(yǎng)法和PCR法檢測。通過比較發(fā)現(xiàn)，PCR法檢出率略高于培養(yǎng)法，在實際操作過程中采用國標(biāo)推薦的分離培養(yǎng)法，全程至少需要3～7 d時間，而PCR法僅需1 d時間即可完成。因此PCR方法在效率和敏感性上都具有較大優(yōu)勢，適合用于實驗動物細菌感染的快速診斷和大規(guī)模的質(zhì)量篩查。但值得注意的是，PCR產(chǎn)物易造成對實驗環(huán)境的污染，導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)，因此在操作過程中應(yīng)盡量避免。

理論上講培養(yǎng)法檢測呈陽性的樣品，PCR法檢測應(yīng)均能檢出。但本研究中有1例樣品經(jīng)培養(yǎng)法檢測金黃色葡萄球菌為陽性，但PCR法檢測為陰性。這一現(xiàn)象在其他類似文獻報道中也出現(xiàn)過[17]，我們認為原因可能是樣品DNA提取失敗，以后的PCR檢測過程中可考慮加入質(zhì)控引物，以評估被檢樣品的DNA模板質(zhì)量是否合格。

綜上，分離培養(yǎng)法和PCR法均能用于實驗動物的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌檢測，應(yīng)將兩者結(jié)合，以達到準(zhǔn)確、高效的目的。對少量樣品進行感染診斷，采用分離培養(yǎng)法較為合適。當(dāng)出現(xiàn)動物疫情爆發(fā)需要快速診斷或進行流行病學(xué)調(diào)查時可采用PCR結(jié)合測序法進行篩查。

參考文獻：

[1]金寧一，胡仲明，馮書章．人獸共患病學(xué)[M]．北京：科學(xué)出版社.2007:552-697

[2]王惠川，白廣星，劉文軍，等．實驗小鼠疾病[M]．北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社.1988： 111-112，153-175，540-548.

[3]Bteieh A，Kimeh P，Sahly H，et al．Klebsiella oxytoca：opportunistic infections in laboratory rodents[J]．LabAnim，2008，42(3)：369-375．

[4]葛文平，張旭，高翔，等．中國商業(yè)化SPF級小鼠病原體污染分析[J]．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(3)：65-68．

[5]邢進，高正琴，馮育芳，等．北京地區(qū)2008-2011年實驗動物綠膿桿菌檢測結(jié)果與分析[J]．實驗動物科學(xué)，2012，29(3)：24-26．

[6]隋麗華，范薇，楊敬，等．實驗動物微生物、寄生蟲抽樣調(diào)查及分析[J]，實驗動物與比較醫(yī)學(xué)，2008，28(4)：259-262．

[7]馮潔，謝建云，胡建華，等．3種條件性致病菌三重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J]．中國畜牧獸醫(yī)，2015，42(6)：1384-1395．

[8]Brakstad O G, Aasbakk K, Maeland J A．Detection ofStaphylococcusaureusby polymerae chain reaction amplification of thenucgene[J]．JClinMicrobiol，1992，7：1654-1660．

[9]譚燕玲，朱瑞良，王慧，等．雞胚胎性病原菌多重PCR檢測方法的建立[J]．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2011，33(5)：374-377．

[10]王瑤，徐英春．臨床細菌和真菌快速診斷技術(shù)[J]．中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2009,32：257-259．

[11]張卓然，高鵬，李琳，等．微生物非培養(yǎng)鑒定技術(shù)在臨床標(biāo)本檢測中的臨床應(yīng)用研究[J]．微生物學(xué)雜志，2009，29：18-24．

[12]張小飛，張召軍，張廣州，等．產(chǎn)腸毒素大腸桿菌快速檢測方法的建立和評價[J]．中國實驗動物學(xué)報，2013，21(5)：31-35．

[13]韋莉，魏立雯，賴國旗，等．金黃色葡萄球菌反向線性雜交探針檢測方法的建立[J]．中國實驗動物學(xué)報，2012，20(6)：78-81．

[14]許一平，成煒，邵彥春，等．沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測[J]．微生物學(xué)通報，2006，33(6)：89-94．

[15]楊明柳，吳斌，湯細彪，等．致豬水腫病大腸桿菌毒力因子二重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]．中國獸醫(yī)學(xué)報，2008，28(9)：996-999．

[16]李偉杰，趙耘，魏財文，等．致豬水腫病大腸埃希菌多重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]．中國畜牧獸醫(yī)，2015，42(3)：537-543．

[17]薛冠華，徐文建，馬曉紅，等. PCR法與培養(yǎng)法檢測兒童肺炎易感細菌結(jié)果比較 [J].北京醫(yī)學(xué)，2012，34(6):466-469．

〔修回日期〕2015-06-17

研究報告

Comparison of culture and PCR assays for detection of

bacteria in laboratory rats and mice

FENG Jie, XIE Jian-yun, FENG Li-ping, WEI Xiao-feng, GAO Cheng

(Shanghai Laboratory Animal Research Center, Shanghai Quality Monitoring Center of

Laboratory Animals, Shanghai 201203, China)

【Abstract】ObjectiveTo compare the efficiency of bacteria culture and PCR assays for detection of Staphylococcusaureus (S. aureus), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) and Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) in laboratory rats and mice. Methods Bacteria culture combined with biochemical identification and PCR assay were used to detect 78 SPF rats and 422 SPF mice and the results of the two methods were compared. Results All the 78 rats were negative. Of the 422 mice, the positive rate by culture was 7.11% (30/422), of which, 10 were S. aureus, 22 were P. aeruginosa, and 2 were K. pneumoniae. The positive rate by PCR was 7.58% (32/422), of which, 10 were S. aureus, 25 were P. aeruginosa, and 2 were K. pneumoniae.ConclusionsThe high sensitivity, rapid procedure and easy to operate of PCR assay makes it valuable for rapid bacteria diagnosis and large-scale screening in laboratory animals.

【Key words】Culture; PCR; Laboratory animals; Bacteria; Staphylococcus aureus (S. aureus), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) and Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) Rats; Mice

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.005

【中圖分類號】R-33

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 08-0023-04

[作者簡介]馮潔(1981-)，女，碩士，副研究員，研究方向：實驗動物質(zhì)量控制，E-mail： moyifj@163.com。

[基金項目]上海市科委基金項目(12140900500、14140900600)。