魏　杰，王　洪，劉甦蘇，陳　航，李芳芳，范昌發(fā)，岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院， 北京　100050)

不同周齡C57-ras轉(zhuǎn)基因小鼠模型雜交1代CB6F1小鼠的臟器及血液學(xué)參數(shù)測(cè)定

魏杰，王洪，劉甦蘇，陳航，李芳芳，范昌發(fā)，岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院， 北京100050)

【摘要】目的測(cè)定4周齡和8周齡不同性別CB6F1小鼠的臟器及血液生理生化指標(biāo)正常值，并比較周齡、性別對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的影響。方法分別取20只雌雄各半的4周齡和8周齡的CB6F1小鼠，活體稱重，解剖稱取主要臟器重量,采血測(cè)定血液生理指標(biāo)和血清生化指標(biāo)。 結(jié)果4周齡和8周齡CB6F1在體重、心、肝、脾、右卵巢、左睪丸、右睪丸、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白濃度(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCH)、血小板壓積(PCT)、平均血小板體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)、淋巴細(xì)胞(LYM)、總蛋白(TP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、磷(P)、甘油三酯(TG)這22項(xiàng)指標(biāo)上差異存在顯著性(P<0.01)，在左腎、右腎、右腎上腺、胸腺、左卵巢、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、單核細(xì)胞百分比(MON%)、尿素(BUN)這8項(xiàng)指標(biāo)上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從性別上比較，4周齡CB6F1在體重、心、肝、脾、肺、左腎、右腎、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、LYM、ALT、ALP、葡萄糖(GLU)、P、總膽固醇(CHO)這14項(xiàng)指標(biāo)上都有雌雄間的顯著差異(P<0.01)，在右腎上腺、WBC、PCT、平均血小板體積(MPV)、總蛋白(TP)、BUN這6項(xiàng)指標(biāo)上存在雌雄間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；8周齡CB6F1在體重、心、肝、肺、左腎、右腎、MCV、PCT、LYM、淋巴細(xì)胞百分比(LYM%)、中性粒細(xì)胞百分比(NEUT%)、ALT、GLU、P、CHO這15項(xiàng)指標(biāo)上都有雌雄間的顯著差異(P<0.01)，在WBC、RBC、MPV、中性粒細(xì)胞(NEUT)、TP這5項(xiàng)指標(biāo)上存在雌雄間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論本文測(cè)定了不同周齡不同性別CB6F1小鼠的臟器及血液生理生化指標(biāo)，為其建立正常檢測(cè)指標(biāo)和應(yīng)用提供參考。

【關(guān)鍵詞】CB6F1小鼠；臟器重量；血液生理生化指標(biāo)

腫瘤是一類威脅人類生命健康的重大疾病。C57-ras轉(zhuǎn)基因小鼠作為常用的自發(fā)腫瘤動(dòng)物模型在腫瘤病理機(jī)制、治療等方向的研究中發(fā)揮著重要作用[1]。然而自發(fā)腫瘤過高，也會(huì)影響其在腫瘤藥物篩選和安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[2]。在實(shí)際工作中為降低自發(fā)腫瘤的背景影響，通常使用的是ras轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與BALB/c雜交F1代CB6F1[3-4]。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臟器重量和血液生理生化參數(shù)都是其主要的生物學(xué)特性指標(biāo)，與其遺傳品質(zhì)密切相關(guān)，也是在藥物長(zhǎng)期毒性研究必須觀測(cè)的項(xiàng)目[5]。已有研究測(cè)定了32周齡的CB6F1小鼠的臟器及血液參數(shù)，但其他周齡小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)尚沒有研究報(bào)道[6]。本文即測(cè)定了不同周齡C57-ras致癌性轉(zhuǎn)基因模型雜交1代CB6F1的臟器及血液學(xué)參數(shù)，為CB6F1小鼠的監(jiān)測(cè)及應(yīng)用提供更為廣泛的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

以本單位雄性C57-ras轉(zhuǎn)基因陽性鼠為父本，雌性BALB/cJ鼠為母本，進(jìn)行交配，并通過PCR方法在F1代中篩選出ras基因陽性鼠CB6F1 (c-Ha-ras+/-)[7]。CB6F1鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，飼喂SPF級(jí)小鼠顆粒飼料，飲用滅菌自來水。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2009-0017。

在4周和8周各取20只，雌雄各半?？崭?2 h后，活體稱重。眼靜脈采抗凝血20 μL測(cè)定血液生理指標(biāo)。摘眼球采全血并分離血清，用以測(cè)定血清生化指標(biāo)。安樂處死后解剖臟器稱量臟器重量。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(京)2011-0008。

1.2主要儀器及設(shè)備

日本光電Mek7222血細(xì)胞分析儀，奧林巴斯AU400全自動(dòng)生化分析儀，Sartorius CPA 423S電子天平。

1.3試劑

清洗液DH520、清洗液DH620、稀釋液DH640、溶血?jiǎng)〥H910、溶血?jiǎng)〥H680均購自上海東湖生物醫(yī)學(xué)有限公司；堿性磷酸酶等13項(xiàng)血清生化指標(biāo)檢測(cè)試劑均來自中生北控生物科技股份有限公司。

1.4測(cè)定項(xiàng)目及方法[8]

體重和臟器指標(biāo)：活體稱重記錄體重。解剖取出心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、卵巢和睪丸，剔除脂肪和包膜，用生理鹽水清洗血漬，濾紙吸干表面水分后用電子天平稱重(單位：g)，精確到0.001 g。

血液生理指標(biāo)：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白濃度(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LYM)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(MON)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NEUT)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(BAS)、淋巴細(xì)胞百分比(LYM%)、單核細(xì)胞百分比(MON%)、中性粒細(xì)胞百分比(NEUT%)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(EOS%)、嗜堿性粒細(xì)胞百分比(BAS%)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、平均血小板體積(MPV)、血小板壓積(PCT)和血小板分布寬度(PDW)，共22項(xiàng)。用日本光電MEK-7222K血球分析儀測(cè)定，儀器精度：WBC 2.0%、RBC 1.5%、HGB 1.5%、MCV 1.0%、PLT 4.0%。

血液生化指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素(BUN)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、鈣(CA)、磷(P)、總膽固醇(CHO)、總膽紅素(Tbili)和甘油三酯(TG)，共13項(xiàng)。用Olympus AU400全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1體重及臟器重量測(cè)定結(jié)果

從4周齡和8周齡總體均值比較，除肺和左腎上腺以外的12項(xiàng)指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)差異。其中，體重、心、肝、脾、右卵巢、左睪丸、右睪丸7項(xiàng)指標(biāo)上都有不同周齡間的差異顯著性(P<0.01)；左腎、右腎、右腎上腺、胸腺、左卵巢5項(xiàng)指標(biāo)在不同周齡間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果詳見表1。

從性別間比較，4周齡CB6F1在體重、心、肝、脾、肺、左腎、右腎7項(xiàng)指標(biāo)上差異都有雌雄間的顯著性(P<0.01)，在右腎上腺指標(biāo)上差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；8周齡CB6F1僅在體重、心、肝、肺、左腎、右腎6項(xiàng)指標(biāo)上差異都有雌雄間的顯著性(P<0.01)。結(jié)果詳見表2。

表1　不同周齡CB6F1的體重臟器指標(biāo)(g)

注：▲表示4周齡和8周齡CB6F1間P<0.05，▲▲表示4周齡和8周齡CB6F1間P<0.01；★表示n=10。

Note.▲indicatesP<0.05 between 4-week-old and 8-week-old CB6F1 mice, while▲▲indicateP<0.01;★indicates n=10.

表2　不同性別CB6F1的體重臟器指標(biāo)(g)

注：▲表示4周齡CB6F1雌雄間P<0.05，▲▲表示4周齡CB6F1雌雄間P<0.01；★★表示8周齡CB6F1雌雄間P<0.01。

Note.▲ indicatesP<0.05 in 4-week-old CB6F1 mice of different genders, while▲▲indicateP<0.01;★★indicatesP<0.01 in 8-week-old CB6F1 mice of different genders.

表3　不同周齡CB6F1的血液生理指標(biāo)

注：▲表示4周齡和8周齡CB6F1間P<0.05，▲▲表示4周齡和8周齡CB6F1間P<0.01。

Note.▲indicatesP<0.05 between 4-week-old and 8-week-old CB6F1 mice, while▲▲indicate thatP<0.01.

2.2生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

從4周齡和8周齡總體均值比較，在WBC、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、PCT、MPV、PDW、LYM這10項(xiàng)指標(biāo)上都有不同周齡間的差異顯著性(P<0.01)，且在RDW、MON%這2項(xiàng)指標(biāo)上差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果詳見表3。

從性別間比較，4周齡CB6F1在WBC、PCT、MPV這3項(xiàng)指標(biāo)上差異有雌雄間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在MCHC、LYM這2項(xiàng)指標(biāo)上差異存在顯著性(P<0.01)；8周齡CB6F1在 WBC、RBC、MPV、NEUT這4項(xiàng)指標(biāo)上差異有雌雄間的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在MCV、PCT、LYM、LYM%、NEUT%這5項(xiàng)指標(biāo)上差異有雌雄間的顯著性(P<0.01)。結(jié)果詳見表4。

2.3生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

從4周齡和8周齡總體均值比較，在TP、ALT、ALB、P、TG這5項(xiàng)指標(biāo)上都有不同周齡間的顯著差異(P<0.01)，而僅在BUN這1項(xiàng)指標(biāo)上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)果詳見表5。

從性別間比較，4周齡CB6F1僅在TP、BUN這2項(xiàng)指標(biāo)上有雌雄間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，在ALT、ALP、GLU、P、CHO這5指標(biāo)上存在顯著差異(P<0.01)；8周齡CB6F1在TP項(xiàng)目上有雌雄間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，在ALT、GLU、P、CHO這4項(xiàng)指標(biāo)上有雌雄間的顯著差異(P<0.01)。結(jié)果詳見表6。

3討論

3.1年齡、性別對(duì)CB6F1小鼠體重及臟器重量的影響

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重及臟器重量受到自身和試驗(yàn)等多種因素影響，在正常狀態(tài)下，主要受性別、年齡、品種等自身因素影響[9]。從本研究中的14項(xiàng)體重臟器指標(biāo)來看，4周齡和8周齡CB6F1小鼠僅在肺重量1項(xiàng)上沒有周齡差異，其余13項(xiàng)均有差異或顯著差異。且隨著周齡增長(zhǎng)，脾、胸腺免疫器官重量呈降低趨勢(shì)，其余指標(biāo)則呈持平或升高趨勢(shì)。這種變化趨勢(shì)符合一般小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育特性。

4周齡CB6F1小鼠僅有胸腺和左腎上腺兩項(xiàng)指標(biāo)沒有性別差異，其余8項(xiàng)均有性別差異。8周齡CB6F1小鼠則在脾、左腎上腺、右腎上腺、胸腺4項(xiàng)指標(biāo)上沒有性別差異，其余6項(xiàng)則差異顯著。不同的周齡和性別的CB6F1小鼠在體重和臟器重量多數(shù)指標(biāo)中均有差異。

3.2年齡、性別對(duì)CB6F1小鼠生理指標(biāo)的影響

本研究共測(cè)定了22項(xiàng)血液生理指標(biāo)。其中，4周齡和8周齡CB6F1小鼠在WBC、RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、PCT、MPV、PDW、LYM、RDW和MON%這12項(xiàng)指標(biāo)上均有差異，其余10項(xiàng)無差異；且隨著周齡增長(zhǎng)，WBC、MCV、MCH、RDW、PLT、PCT、MPV、PDW、NEUT、LYM%、MON%、NEUT%這12項(xiàng)指標(biāo)有降低趨勢(shì)，其余10項(xiàng)指標(biāo)呈持平或升高趨勢(shì)。

表4　不同性別CB6F1的血液生理指標(biāo)

注：▲表示4周齡CB6F1雌雄間P<0.05，▲▲表示4周齡CB6F1雌雄間P<0.01；★表示8周齡CB6F1雌雄間P<0.05，★★表示8周齡CB6F1雌雄間P<0.01。

Note.▲indicatesP<0.05 in 4-week-old CB6F1 mice of different genders,▲▲indicateP<0.01;★indicatesP<0.05 in 8-week-old CB6F1 mice of different genders，★★indicatetP<0.01.

表5　不同周齡CB6F1的血清生化指標(biāo)

注：▲表示4周齡和8周齡CB6F1間P<0.05，▲▲表示4周齡和8周齡CB6F1間P<0.01。

Note:▲showsP<0.05 between 4-week-old and 8-week-old CB6F1 mice,▲▲indicateP<0.01.

表6　不同性別CB6F1的血清生化指標(biāo)

注：▲表示4周齡CB6F1雌雄間P<0.05，▲▲表示4周齡CB6F1雌雄間P<0.01；★表示8周齡CB6F1雌雄間P<0.05，★★表示8周齡CB6F1雌雄間P<0.01。

Note.▲indicatesP<0.05 in 4-week-old CB6F1 mice of different genders,▲▲indicateP<0.01;★indicatesP<0.05 in 8-week-old CB6F1 mice of different genders，★★indicateP<0.01.

4周齡CB6F1小鼠有WBC、MCHC、PCT、MPV、LYM這5項(xiàng)指標(biāo)有性別差異，其余17項(xiàng)沒有性別差異。8周齡CB6F1小鼠則在WBC、RBC、MPV、NEUT、MCV、PCT、LYM、LYM%、NEUT%這9項(xiàng)上有性別差異，其余13項(xiàng)無性別差異。血液生理指標(biāo)在成年CB6F1小鼠中的性別差異更為明顯。

3.3年齡、性別對(duì)CB6F1小鼠生化指標(biāo)的影響

在測(cè)定的13項(xiàng)血清生化指標(biāo)中，4周齡和8周齡CB6F1小鼠在TP、ALT、ALB、P、TG、BUN這6項(xiàng)指標(biāo)上存在差異，其余7項(xiàng)無差異；且隨著周齡增長(zhǎng)，ALP、BUN、GLU、CA、P、CHO、TG這7項(xiàng)指標(biāo)呈降低趨勢(shì)，其余6項(xiàng)呈升高趨勢(shì)。

4周齡和8周齡CB6F1小鼠雌雄間均有1項(xiàng)(TP)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)、4項(xiàng)(ALT、GLU、P、CHO)顯著差異(P<0.01)和6項(xiàng)(AST、ALB、CREA、CA、TG、T.Bili)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。僅有ALP和BUN兩項(xiàng)在4周齡CB6F1小鼠中差異顯著而8周齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。血液生化指標(biāo)在未成年CB6F1小鼠中的性別差異更為明顯。

3.4CB6F1的選擇與應(yīng)用

CB6F1小鼠是一種在腫瘤及藥物篩選中有著重要應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[4]。OECD規(guī)定需要使用6～8周齡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行致癌性實(shí)驗(yàn)。左琴等[6]曾對(duì)32周齡的CB6F1小鼠的血液生理生化和臟器重量進(jìn)行過研究，比較了ras基因轉(zhuǎn)入對(duì)于該周齡小鼠各項(xiàng)指標(biāo)的影響，但對(duì)不同周齡的CB6F1小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)尚沒有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究了4周齡和8周齡的CB6F1小鼠體重、臟器重量、生理生化指標(biāo)，為進(jìn)行致癌性實(shí)驗(yàn)提供了初始可參考數(shù)據(jù)，同時(shí)通過比較年齡、性別對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的影響，也為其應(yīng)用提供了更廣泛的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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〔修回日期〕2015-06-28

研究報(bào)告

Determination of hematological and visceral weight parameters of

F1 carcinogenesis transgenic C57-rasmodel CB6F1 mice

WEI Jie, WANG Hong, LIU Su-su, CHEN Hang, LI Fang-fang, FAN Chang-fa, YUE Bing-fei

(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

【Abstract】ObjectiveTo determine the normal range of hematological and visceral weight parameters of F1 4-week and 8-week old, male and female transgenic CB6F1 mice. The influence of gender and week age on the biochemical parameters was assessed. Methods 4-week and 8-week old CB6F1 mice, half male and half female (n=20 in each group), were weighed alive, dissected to weigh the main viscera, and blood samples were collected to test the physiological and biochemical parameters. Results When 4-week old and 8-week old CB6F1 mice were compared, there were significant differences in 22 parameters (body weight, heart, liver, spleen, left ovary, left testis, right testis, WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, PCT, MPV, PDW, LYM, TP, ALT, ALB, P and TG) (P<0.01 for all), and in 8 parameters (left kidney, right kidney, right adrenal, thymus, left ovary, RDW, MON% and BUN) (P<0.05 for all). When male and female 4-week CB6F1 mice were compared, there were significant differences in 14 parameters (body weight, heart, liver, spleen, lung, left kidney, right kidney, MCHC, LYM, ALT, ALP, GLU, P and CHO) (P<0.01 for all), and in 6 parameters (right adrenal, WBC, PCT, MPV, TP and BUN) (P<0.05 for all). For male and female 8-week old CB6F1 mice, there were significant differences in 15 parameters (body weight, heart, liver, lung, left kidney, right kidney, MCV, PCT, LYM, LYM%, NEUT%, ALT, GLU, P and CHO) (P<0.01 for all), and in 5 parameters (WBC, RBC, MPV, NEUT and TP) (P<0.05 for all). ConclusionsThe normal range of hematological and visceral weight parameters of 4-week and 8-week old male and female CB6F1 mice are determined. Our study establishes normal detection indexes of CB6F1 mice and provides useful reference for its application.

【Key words】CB6F1 mice; Viscera weight; Blood physiological and biochemical parameters

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.002

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 08-0006-06

[通訊作者]岳秉飛(1960-)，男，研究員，博士。研究方向：動(dòng)物遺傳學(xué)。E-mail： y6784@126.com。

[作者簡(jiǎn)介]魏杰(1982-)，女，碩士。研究方向：免疫遺傳檢測(cè)。E-mail： jane3040320@163.com。

[基金項(xiàng)目]國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2013BAK11B03)。