于 茜，王 凡，劉宏斌

(解放軍總醫(yī)院南樓心血管內(nèi)科，北京 100853)

血小板作為血液中一種特殊的細胞成分，廣泛參與了炎癥、宿主防御、組織修復等生理過程，但最重要的仍是參與正常的止血功能[1,2]。因此，抗血小板治療廣泛發(fā)展與應用的同時，利用血小板功能檢測方法監(jiān)測抗血小板治療的有效性及識別動脈疾病高風險患者越來越重要。隨著對血小板多方面功能的認識以及社會科技進步，出現(xiàn)了各種基于不同原理的檢測方法。但由于技術處理或原理的單一性，目前大多處于實驗室研究階段，臨床應用受限。本文對近年來實驗室或臨床的常用設備作一綜述，綜合分析利弊。

1 血小板聚集功能分析方法

1.1 光比濁法

1.1.1 原理介紹 20世紀60年代，Born設計了光比濁法(light transmission aggregometry，LTA)，其作為血小板檢測方法的金標準直到現(xiàn)在地位仍是不可動搖的，是很多鑒別和診斷血小板功能缺陷的專業(yè)實驗室最為常用的方法[3]。LTA的測試原理是計算富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)樣品的透光度變化。PRP是含有大量懸浮細胞的渾濁溶液，懸浮細胞會大大減少光的透射。血小板聚集堆在激活劑加入后出現(xiàn)，懸浮細胞沉淀，光透射增加(100%設定為乏PRP)，隨血小板聚集實時測量動力學變化。設備配備自動設置功能(透光度為100%及0%的條件)、存儲軟件和配有攪拌棒的一次性比色杯。設備將獲得信號自動轉(zhuǎn)化為曲線圖形，與透光度的變化平行。在PRP中，不同的激活劑加入可致不同的血小板途徑活化，從而可了解血小板功能的不同特性。最常用的激活劑有二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、膠原和腎上腺素。

1.1.2 優(yōu)缺點 LTA能用多種激活劑及不同濃度引發(fā)血小板激活及聚集，因此提供了學習更多血小板激活途徑細節(jié)的機會；且因LTA與出血及缺血事件相關，成為在過去50年里大多數(shù)專業(yè)實驗室備受歡迎的檢測方法[4]。盡管LTA被認為重要且全面，但還是存在一些特殊問題：(1)受不同的分析前條件(如：抗凝血藥類型、血漿脂質(zhì)、溶血、低血小板計數(shù))影響；(2)不同的程序條件(如PRP的準備、不同濃度的激活劑)易造成誤差；(3)在完成實驗和解釋結(jié)果中，需實驗室人員具備良好的技術、經(jīng)驗和專業(yè)知識；(4)試驗中的條件未能精確模擬生理條件[3,4]。因此，LTA需要不斷地被發(fā)展的標準化過程驗證[5]。

1.1.3 臨床應用 LTA是血小板檢測方法的金標準，是診斷多種血小板缺陷和監(jiān)測抗血小板治療的最常用技術[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7]，瑞斯托菌素能促進血管性血友病因子(von willebrand factor，VWF)和糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅰb/Ⅸ/Ⅴ復合物的整合，可作為激活劑發(fā)現(xiàn)血管性血友病和血小板功能失調(diào)(如Bernard-Soulier綜合征)。用LTA監(jiān)測抗血小板治療能在高風險心血管患者中預測主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACE)，由ADP-LTA和AA-LTA定義的殘留血小板活性率，均與缺血事件(如急性冠脈綜合征、穩(wěn)定型心絞痛)的發(fā)展相關。目前在實驗室或臨床研究中，常用由ADP和AA觸發(fā)的血小板聚集截點值鑒別那些對抗血小板制劑沒有反應且高風險MACE的急性冠脈綜合征患者[8]。

1.2 VerifyNow系統(tǒng)

1.2.1 原理介紹 VerifyNow是全自動的快速檢測系統(tǒng)，用于監(jiān)測抗血小板治療[9]。原理為血小板聚集到試劑盒內(nèi)纖維蛋白原覆蓋的珠子上，與活化的GPⅡb/Ⅲa受體成比例。光學濁度計反應的透光度隨激活的血小板與附著在球體的纖維蛋白原的聚集而增加，凝集隨透光增加的程度而增大。在這項檢測方法中，凝血酶受體激活肽(thrombin receptor activating peptide，TRAP)用作激活劑，最大程度刺激血小板聚集。以聚集速率和程度計算血小板聚集單位(platelet aggregation units，PAU)。目前，又有對靶向藥物敏感的2個試劑盒可用：(1)用阿司匹林作為激活劑表達為阿司匹林反應單位(aspirin reaction units，ARU)；(2)PRU試驗(對噻吩并吡啶治療敏感)表達為P2Y12 反應單位(P2Y12 reaction units，PRU)。

1.2.2 優(yōu)缺點 檢測快速，采用全血，無需樣本預處理和運輸，無需專業(yè)實驗室或操作者，無需用藥前基礎值，致聚劑和抗凝劑的作用無影響[8]。影響試驗的因素包括：取血進入試驗的時間、血小板計數(shù)、血細胞比容、甘油三酯、纖維蛋白原水平。此外，試驗設備昂貴，因此大多用于科研[10]。

1.2.3 臨床應用 Verifynow系統(tǒng)被廣泛用于監(jiān)測急診心臟手術室的抗血小板治療，無需專業(yè)實驗室?guī)椭鶾10]。2014年《抗血小板藥物治療反應多樣性臨床檢測和處理的中國專家建議》中提出[11]，P2Y12抑制劑治療反應監(jiān)測推薦應用VerifyNow或血小板血管擴張劑刺激磷蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP)檢測，無條件時可采用LTA方法，但需注意操作標準化。另外，Verifynow系統(tǒng)在抗血小板治療患者中的應用已擴展至外科，嘗試預測術后出血[12]。

1.3 Plateletworks分析儀

1.3.1 原理介紹 Plateletworks是一種即時檢驗分析儀，用于診斷性篩選試驗。分析儀用阻抗法比較對照樣品乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid， EDTA)管中的血小板計數(shù)和添加ADP或AA后聚集的試驗樣品(檸檬酸鹽管)中的血小板計數(shù)。

1.3.2 優(yōu)缺點 無需處理全血、結(jié)果即刻獲得，比LTA重復性較好，充實了血小板整體功能中血小板計數(shù)的角色，可應用在血小板減少患者中[13]。不利因素是試驗需在采集血樣后的幾分鐘內(nèi)進行，嚴格的時間控制使這項設備在操作區(qū)域上應用受限。

1.3.3 臨床應用 Plateletworks分析儀將有可能成為心臟介入或外科手術中有用的工具，在急診護理條件下，Plateletworks也可顯示出檢測血小板計數(shù)和功能的臨床價值[14]。

2 基于凝血塊形成及穩(wěn)定性的分析方法——血栓彈力圖

2.1 原理介紹

血栓彈力圖(thromboelastography，TEG)為整體止血過程，目前常用的是TEG分析儀5000系列[15]，動態(tài)監(jiān)測從凝血開始至血小板聚集、血凝塊形成以及纖維蛋白溶解的整體過程，以血塊形成及溶解過程中全血在粘彈力上的變化為分析基礎[15,16]。根據(jù)所用試劑可進行不同的試驗，了解不同途徑的止血：如添加肝素酶能評估全血中肝素的抗凝程度，添加血小板受體激活劑(如ADP或AA)能監(jiān)測抗血小板藥物療效。

2.2 優(yōu)缺點

試驗能很快完成(<30 min)，允許全血成分之間的相互作用，更接近生理狀態(tài)，能提供完整的凝血輪廓，不受肝素類物質(zhì)的影響。缺點在于實驗室之間可能存在變異性[17]，且TEG需在37℃ 進行，無法監(jiān)測較低溫度時患者的凝血動態(tài)。

2.3 臨床應用

TEG已在成分輸血、創(chuàng)傷、急診、外科手術(如心臟手術、肝移植、產(chǎn)科手術等)及臨床試驗等領域得到廣泛應用，用于評估術后出血風險[18]。還可在冠心病個體中評價凝血狀態(tài)，監(jiān)測不同抗栓療效，協(xié)助擬定個體化治療方案，減少血栓和出血風險。血小板圖檢測已被證實可靠且分析變異小[19]。然而，更大規(guī)模的前瞻性研究還有待完成，以明確這些設備在監(jiān)測抗血小板治療中的合適角色。

3 流式細胞儀

3.1 原理介紹

流式細胞儀(flow cytometry，F(xiàn)C)血小板分析能提供在體血小板功能狀態(tài)信息，是分子水平觀察血小板聚集功能的一種新方法[20,21]。常用的血小板活化標志物包括：血小板表面表達的P選擇素(CD62p標記，作為α分泌顆粒的標志)、膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa復合物(用單克隆抗體PAC-1檢測)和VASP(作為P2Y12受體活化依賴信號標志)。通過免疫熒光標記后，由光學系統(tǒng)激發(fā)出不同散射光，光電信號傳入計算機系統(tǒng)處理，結(jié)果再以平均熒光強度暗指細胞數(shù)量的直方圖表現(xiàn)出來。通過測定循環(huán)中活化血小板(circulating activated platelets，CAP)判斷血小板的功能狀態(tài)。

3.2 優(yōu)缺點

用少量全血即可完成，避免樣品準備步驟，允許生理環(huán)境中血小板相互作用，且能單獨完成血小板計數(shù)[22]。但設備昂貴，需要專業(yè)操作者及相關培訓，且分析前階段需精心準備防止誤差產(chǎn)生[22]；測定的蛋白分子活性敏感度高，易受多種實驗條件的影響[23]；解釋結(jié)果有主觀性，造成實驗室之間重復性及可比性差。

3.3 臨床應用

近年來FC分析血小板功能被廣泛應用，如測量血小板計數(shù)，明確血小板活化狀態(tài)，診斷血小板受體功能或數(shù)量異常，監(jiān)測抗血小板藥物療效。FC能發(fā)現(xiàn)很多遺傳性或獲得性血小板功能失調(diào)和儲存池疾病，被認為是檢測血小板病的首選試驗[22]。FC還能識別血小板的促凝能力和激活狀態(tài)(如在急性冠脈綜合征或體外循環(huán)時)，評估血庫中儲存血小板的狀態(tài)[24]。但目前研究表明，PAC-1和CD62p蛋白分子因不穩(wěn)定而不適宜于抗血小板療效常規(guī)檢測[23]。

4 剪切力誘導血小板聚集的方法

4.1 血小板功能分析儀

4.1.1 原理介紹 20世紀90年代中期，血小板功能分析儀(platelet function analyzer，PFA)-100設備更新為PFA-200并投入使用，被認為是測試出血時間(bleeding time，BT)的標準化體外替代試驗[25]。少量檸檬酸鹽全血在高剪切力條件下通過毛細管抽吸到覆蓋不同激活劑的帶孔(147 μm)薄膜上，激活劑結(jié)合高剪切力在試劑盒中激活血小板，發(fā)生聚集。設備測量剪切力下減慢或停止的全血血流，以及血小板聚集封鎖孔隙的時間(closure time，CT)。試驗包括兩種試劑盒：膠原和ADP(CADP試劑盒)或者腎上腺素(CEPI試劑盒)。FDA已批準第3種INNOVANCE PFA P2Y試劑盒用來檢測P2Y12途徑，監(jiān)測抗血小板藥物如氯吡格雷的療效；試劑盒中薄膜孔更小(100 μm)，內(nèi)含ADP和PGE1的結(jié)合物[26]。

4.1.2 優(yōu)缺點 測試簡單快速，只需少量全血，無需多余的樣品準備及大量的專業(yè)技術培訓[4]。另外，此試驗陰性預測值較高，尤其對于嚴重血小板功能缺陷和血管性血友病(von willebrand disease，VWD)Ⅱ、Ⅲ型[27]。但是，PFA-100/200對多種影響血小板功能的因素敏感，血小板計數(shù)、血細胞比容及抗凝劑特性會影響CT，因此在血小板<50×109/L或血細胞比容<25%時，臨床醫(yī)師需要仔細結(jié)合考慮[3]。另外，高VWF、纖維蛋白原、紅細胞水平可能縮短CEPI CT[27]。

4.1.3 臨床應用 試驗應用剪切力模擬在體條件，相當高水平依靠VWF，適合篩選VWD及其治療監(jiān)測[28]。但PFA-100/200方法對微小血小板功能缺陷不敏感，需要被更多專業(yè)實驗證實[27]。在抗血小板藥物療效檢測方面，PFA雖然顯示了與LTA、TEG較高的一致性，但方法學依賴性高，實用性稍差，仍需更嚴格的質(zhì)控[29]。

4.2 Cone and Plate(Let)分析儀

4.2.1 原理介紹 一種創(chuàng)新的快速檢測方法，人工在聚氯乙烯板(含促血栓形成物質(zhì))加樣孔中添加少量全血，椎體旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生剪切力刺激血小板活化、黏附，將多余血液成分洗掉后自動染色，通過顯微鏡觀察，軟件拍攝一系列加樣板連拍圖像，測量其表面覆蓋血小板聚集物的百分數(shù)(代表血小板黏附)和聚集堆平均大小(代表血小板聚集)。

4.2.2 優(yōu)缺點 設備全自動化，無需移液，無需樣品準備，簡單快速可行，但依賴血漿、血細胞比容及血小板計數(shù)。裝置中剪切力可調(diào)，可模擬血小板生理環(huán)境或接近于動脈粥樣硬化疾病的病理狀況[30]。

4.2.3 臨床應用 此設備相關臨床經(jīng)驗少，很少應用于臨床大樣本中。該系統(tǒng)可相容性診斷血小板缺陷，但價值不大，臨床實用性仍需評估[31]。

5 檢測血栓素代謝物的方法

5.1 原理介紹

血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)是血小板活化后由AA快速合成的，在磷脂膜釋放。TXA2增強血小板活化，招募其他血小板到血管損傷部位，引起血管收縮，加速止血過程。因為半衰期短，TXA2在血漿或全血中很難檢測，最常用的代謝物是血栓烷素B2(thromboxane B2，TXB2)和11-去氫-血栓烷B2(DH-TXB2)，后者較前者更穩(wěn)定。關于TXA2代謝物的定量分析，放射免疫測定法已過時棄用，目前常用酶聯(lián)免疫測定或質(zhì)譜分析法[32]，采用37℃全血凝固30～60 min后的血漿或血小板活化聚集后PRP血漿檢測TXB2，或在尿液中檢測DH-TXB2。

5.2 優(yōu)缺點

測量TXA2代謝物可直接評估在體環(huán)氧合酶途徑，了解血小板活化狀態(tài)。但血小板生物合成TXA2的量(1～2 pg/mL)和容量(300～400 ng/mL)之間有很大差異。因此，有人認為在血清或血漿中檢測TXB2受取樣時人工激活血小板的影響。

5.3 臨床應用

血清和尿中TXB2濃度與TXA2生物合成密切相關，在不同疾病中其含量不同。目前廣泛用于發(fā)現(xiàn)血栓素合成缺陷及對阿司匹林的反應[22,33]。在血小板對AA反應異常時，測量TXA2代謝物能鑒別因?qū)ρ逅厥荏w反應下降血小板產(chǎn)生TXA2能力的異常[34]。

6 總 結(jié)

迄今，已出現(xiàn)基于各種不同原理的試驗設備用于檢測部分或整體的血小板功能，越來越多的方法更多關注于凝血、出血障礙以及監(jiān)測抗血小板治療有效性。隨著技術發(fā)展，試驗方法或設備的升級能指導臨床醫(yī)師對出血風險做更正確快速的診斷，在術前、術后更精準地調(diào)整抗血小板方案。雖然前景美好，在各種檢測方法之間也存在著很大問題：檢測方法缺乏明確的指南或指征；不同檢測方法之間相關性差；缺少精確分析前的質(zhì)量控制以減少人工誤差[30]。因此，除提高試驗及設備可用性外，可靠性以及質(zhì)控測試的研究顯得日益重要。

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