張為民 譚杰 阿布都沙拉木·吐爾遜 葉爾買克·唐沙爾汗 張總剛

臨床研究

新疆地區(qū)維吾爾族先天性心臟病患者CITED2基因突變分析

張為民 譚杰 阿布都沙拉木·吐爾遜 葉爾買克·唐沙爾汗 張總剛

目的 分析新疆維吾爾族先天性心臟?。–HD）患者與CITED2基因突變的關(guān)系。方法 收集150例散發(fā)型維吾爾族CHD患者和150例健康維吾爾族人群血液樣本進(jìn)行DNA提取、目的基因聚合酶鏈反應(yīng)及測(cè)序，與GeneBank進(jìn)行比較以識(shí)別基因突變，并分析氨基酸序列。結(jié)果 一例室間隔缺損患者發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的純合突變c.574A>G，并導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸序列錯(cuò)義突變（p.Ser192Gly），該突變?cè)贑ITED2基因絲氨酸-甘氨酸富含區(qū)，而在健康對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)此突變。結(jié)論 新疆維吾爾族CHD患者中首次發(fā)現(xiàn)了CITED2基因純合突變，Serl92GIy突變所在序列呈現(xiàn)一定保守性，可能與CHD發(fā)生有關(guān)。

先天性心臟病； 基因； CITED2； 突變

先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）是由于心臟、血管在胚胎期發(fā)育障礙所導(dǎo)致的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能異常，其發(fā)病率在活產(chǎn)嬰兒中為6‰～8‰[1]。目前認(rèn)為CHD是一種多基因遺傳病，是胚胎時(shí)期遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。心臟發(fā)育過程中單個(gè)或多個(gè)基因的突變及功能異常均可能導(dǎo)致心臟畸形的發(fā)生。CITED2（CBP/P300-interacting transactivator ED-rich 2）是轉(zhuǎn)錄輔助因子CITED家族中的重要一員，在心臟正常發(fā)育過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，CITED 2敲除小鼠可伴有多種心臟畸形，在胚胎期即可死亡[2,3]。小鼠遺傳基因與人類基因具有較高的同源性，提示CITED2突變可能是人類CHD發(fā)生的原因之一，國(guó)內(nèi)外已有此方面的研究報(bào)道[4-10]。由于CHD具有顯著的遺傳異質(zhì)性，有必要在不同種族人群中對(duì)CITED2基因進(jìn)行研究。據(jù)此，本研究擬通過檢測(cè)新疆地區(qū)維吾爾族CHD患者CITED2基因的編碼序列，了解其在維吾爾CHD患者的突變情況，以探索CHD發(fā)生的病因。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2013年1月至2015年10月新疆自治區(qū)人民醫(yī)院心外科收集新疆地區(qū)維吾爾族CHD患者150例（研究組），年齡3個(gè)月至60歲，其中男性68例、女性82例，中位年齡30歲；均經(jīng)超聲心動(dòng)圖和外科手術(shù)確診。其中室間隔缺損（ventricular septal defect，VSD）39 例，房間隔缺損（atrial septal defect，ASD）101例，房間隔缺損合并室間隔缺損5例，動(dòng)脈導(dǎo)管未閉（patent ductus ateriosus，PDA）3 例，肺動(dòng)脈狹窄（pulmonary stenosis，PS）2例。同時(shí)收集150名體檢正常維吾爾人作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象無血緣關(guān)系。本研究征得研究對(duì)象/監(jiān)護(hù)人知情同意，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 血液標(biāo)本采集和基因組DNA提取 試驗(yàn)組及對(duì)照組均抽取外周血5 ml，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，使用基因組DNA抽提試劑盒（QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit，天根生化科技北京有限公司）提取全血基因組DNA，-20℃存放備用。

1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物完全覆蓋CITED2基因的不同區(qū)域。共設(shè)計(jì)1對(duì)引物，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。引物PF5′-AGGCTGTTAGTGGGATCTTGG-3′，PR5′-TGGGTGAATGTCAAGGCTACA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度 1189 bp。20μl PCR反應(yīng)體系中，基因組DNA 2μl，聚合酶鏈反應(yīng)體系（Goldstar Best MasterMix北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）10μl，水6μl。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃10 min，變性 95℃ 30 s，退火 64℃ 30 s，延伸 72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)，終延伸72℃ 10 min。所有PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3 DNA測(cè)序及突變分析 所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均采用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化，在ABI3730XL測(cè)序儀型全自動(dòng)DNA序列分析儀上進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中的CITED2基因標(biāo)準(zhǔn)序列（NM_006079.4）進(jìn)行比對(duì)，以明確核苷酸變異的位點(diǎn)和類型。在國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)庫檢索有關(guān)CITED2基因文獻(xiàn)，確定其變異是否是已報(bào)道突變或是新突變。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，病例組和對(duì)照組CITED2基因編碼序列均擴(kuò)增成功，見圖1。

2.2 測(cè)序結(jié)果 將所有病例及對(duì)照樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，與基因數(shù)據(jù)庫中的CITED2基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)。在CHD樣本中檢測(cè)到1例CITED2純合突變，而正常對(duì)照樣本中未檢測(cè)到。病例為一例VSD患者，其編碼鏈第574位堿基由A替換為G（c.574A＞G），引起192位氨基酸密碼子由AGC變?yōu)镚GC（圖2），使相應(yīng)氨基酸發(fā)生改變（p.Serl92G1y）而造成錯(cuò)義突變，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)改變。經(jīng)文獻(xiàn)檢索查詢發(fā)現(xiàn)此突變位點(diǎn)已有報(bào)道[6,9,10]，但均為此位點(diǎn)的雜合突變報(bào)道，此位點(diǎn)純合突變報(bào)道尚數(shù)首次。

3 討論

大量研究表明，CHD是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的一種多基因遺傳疾病。心臟發(fā)育是個(gè)極其復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，它涉及多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在胚胎發(fā)育過程中不同時(shí)間、不同空間的先后表達(dá)和相互作用。任何一個(gè)基因結(jié)構(gòu)或量的異常均可導(dǎo)致心臟發(fā)育異常。近年來大量研究表明，CITED2基因在心臟和神經(jīng)管發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[2,3]。盡管其功能尚未被完全揭示，但普遍認(rèn)為它與心臟發(fā)育密切相關(guān)。

人類CITED2基因定位于染色體6q23.3，基因全長(zhǎng)2390 bp，含有2個(gè)外顯子和1個(gè)小內(nèi)含子，編碼鏈位于第2外顯子，共編碼270個(gè)氨基酸。Cited2基因序列的特點(diǎn)為：具有一個(gè)罕見的CpG（3 kb）島；梭基末端具有一個(gè)由（CGG）n簡(jiǎn)單重復(fù)序列組成的特殊絲氨酸-甘氨酸富含區(qū)（serine-glycine richjunction，SGJ），該區(qū)對(duì)應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)位于Ser161-G1y199；基末端包含長(zhǎng)為 32個(gè)氨基酸（Asp224-Phe255）的CBP/p300結(jié)合序列。其獨(dú)特的基因序列決定CITED2基因作為轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子，在胚胎發(fā)育和細(xì)胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞，參與HIF-1、NF-kB、TFAP2等因子的轉(zhuǎn)錄過程，共同影響心臟結(jié)構(gòu)的發(fā)育[2,11-13]。此外，CITED2可通過Nodal-Pitx2途徑影響心臟左右對(duì)稱體軸的形成[14]。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)，CITED2基因突變可引起HIF1A的表達(dá)，導(dǎo)致與心臟發(fā)育有關(guān)的VEGF和PITX2C的表達(dá)下調(diào)，從而降低CITED2和TFAP2C反式激活PITX2C的協(xié)同作用。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，CITED2-/-小鼠在胚胎期死于多種心臟畸形，包括ASD、VSD、房室間隔缺損（atrioventricular，AVSD）、右心室雙出口（double outlet right ventricle，DORV）、永存動(dòng)脈干（persistent truncus arteriosus，PTA）、法洛四聯(lián)癥（Tetralogy of fallot，TOF）、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位（transposition of great arteries，TGA）、主動(dòng)脈弓離斷（interrupted aortic arch，IAA）、PS、右心房異構(gòu)以及異常心袢的形成等[2,3]，表明該基因在小鼠胚胎心臟的發(fā)育中起重要作用。目前已在人類CHD患者中發(fā)現(xiàn)了數(shù)種CITED2基因突變，疾病表型為VSD和（或）ASD、TOF等[4-10]，與CITED2-/-敲除小鼠表現(xiàn)出多樣的CHD表型相吻合。Sperling等[4]最早在392例CHD患兒中發(fā)現(xiàn)3種CHD的CITED2基因致病插入或缺失突變p.Serl70-Glyl78del、p.Gly178-Serf 79ins9 和 p.Serl 98-Glyl99de1，患者臨床表型為VSD、ASD和肺靜脈異位連接（anomalous pulmonary venous connection，APVC）。Chen等[7]在 1126例散發(fā)型 CHD 患者中發(fā)現(xiàn) 5個(gè)致病突變，p.Asn62Se、p.Arg92Gly、p.Thr166Asn、p.Ala187Thr 和 p.Gly180_Ala187del，患者臨床表型 TOF、ASD、TGA、AVSD 和 PS。

國(guó)內(nèi)有研究團(tuán)隊(duì)也在不同CHD患兒中發(fā)現(xiàn)了CITED2基因不同位點(diǎn)的突變。彭婷等[5]對(duì)101例CHD患兒進(jìn)行篩查，1例PDA患兒被發(fā)現(xiàn)1種插入突變p.Serl61-G1y162ins。楊曉菲等[6]和Xu等[9]在120例CHD患兒中發(fā)現(xiàn)3個(gè)潛在CITED2致病突變 p.G1yl 84Ser、p.Serl92Gly、p.Serl92fs，患兒臨床表型為鏡面右位心伴TOF、主動(dòng)脈瓣狹窄(aortic stenosis，AS)、AS 伴 PS。Liu 等[8]聯(lián)合數(shù)家醫(yī)院對(duì)700例CHD患兒進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)5個(gè)潛在致病突變 ，p.Pro140Ser、p.Ser183Leu、p.Ser196G1y、p.Serl61 delAGC和p.Ser192_Gly 193delAGCGGC，患者臨床表型為ASD、VSD、TOF。楊小萌等[10]對(duì)368例CHD患者進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)2個(gè)潛在CITED2致病突變，p.Ser192Gly和p.Ser96Phe，患者臨床表型為VSD和PDA。

本研究通過對(duì)150例維吾爾族CHD患者CITED2基因外顯子序列的檢測(cè)，僅1例VSD患者被發(fā)現(xiàn)有1種CITED2基因錯(cuò)義突變c.574A>G（p.Serl92Gly）。該位點(diǎn)突變?yōu)橐延袌?bào)道，臨床表型為AS和VSD。該位點(diǎn)攜帶雜合A/G基因型者均患CHD，而對(duì)照人群攜帶純合AA基因型，先前研究均未發(fā)現(xiàn)純合GG基因型。我們發(fā)現(xiàn)的c.574A>G純合突變報(bào)道尚數(shù)首次，p.Serl92Gly突變所在序列均呈現(xiàn)一定保守性。Sperling等[4]認(rèn)為，SGJ區(qū)域的插入或缺失突變可能會(huì)導(dǎo)致該區(qū)域的蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，進(jìn)而影響CITED2基因的CBP/p300結(jié)合結(jié)構(gòu)域與CBP/p300或其他輔助因子的相互作用，最終導(dǎo)致心臟畸形的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)p.Serl92Gly在SGJ區(qū)域?qū)?yīng)的DNA序列，為SGJ是CHD的致病突變熱點(diǎn)區(qū)域的觀點(diǎn)進(jìn)一步提供了臨床依據(jù)。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于CHD患者CITED2基因編碼區(qū)突變報(bào)道，僅在極少數(shù)病例中檢測(cè)到CITED2基因編碼區(qū)的突變。雖然很多學(xué)者認(rèn)為CITED2基因的突變可能是CHD致病機(jī)制之一，僅從單純基因突變不能完全解釋基因與CHD的關(guān)系，還需要對(duì)其相關(guān)的遺傳-環(huán)境共同作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

（本文圖片封三）

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Study of association between CITED2 gene mutation and congenital heart disease in Uygur patients in Xinjiang

ZHANG Wei-min＊，TAN Jie，Abudushalamu·Turxun，et al.＊Department of Cardiac Surgery，the People′s Hospital of the Xinjiang Uyghur Autonomous Region，Urumqi 830001，China

Objective To investigate the association of CITED2 gene mutation with congenital heart disease（CHD）in Uygur patients in Xinjiang.Methods The blood samples were collected from 150 Uygur patientswith sporadic CHD admitted in the People′s General Hospital of Xinjiang from January 2013 to October 2015.One hundred and fifty unrelated healthy Uygur individuals were used as controls.The coding region of CITED2 was amplified by PCR.The PCR products were sequenced and compared to GeneBank sequence databases.Results A homozygous A to G mutation was found in one patient with ventricular septal defect at nucleotide 574 in coding region of CITED2 gene，resulting in a missense mutation（p.Serl92Gly）which located in Serine-glycine rich junction（SGJ）region.Other patients and healthy individuals were normal.Conclusion The CITED2 gene homozygous mutation was first discovered in the Uygur CHD patients in Xinjiang，and the sequence of the mutation（p.Serl92Gly）was conservative，which may be one of the cause for CHD.

Congenital heart disease； Gene； CITED2； Mutation

ZHANG Wei-min，E-mail：xjourheart@163.com

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：2014211A064）

830001 新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心外科（張為民、阿布都沙拉木·吐爾遜、葉爾買克·唐沙爾汗、張總剛），麻醉科（譚杰）

張為民，E-mail：xjourheart@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．11．010

R541.1

A

1672-5301（2016）11-0997-04

2016-07-18）