蘇林博 謝蓮娜 王凱君 王麗君 黨鳳強(qiáng) 張一凡

基礎(chǔ)研究

阿托伐他汀對(duì)冠脈痙攣大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及RhoA活性的影響

蘇林博 謝蓮娜 王凱君 王麗君 黨鳳強(qiáng) 張一凡

目的 探討阿托伐他汀預(yù)處理對(duì)垂體后葉素致冠狀動(dòng)脈痙攣大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及冠狀動(dòng)脈RhoA活性的影響。方法 50只SD大鼠隨機(jī)分為5組，正常組（無(wú)特殊處理）、對(duì)照組（生理鹽水）、阿托伐他汀組（5 mg·kg-1·d-1）、硝苯地平組（5 mg·kg-1·d-1）和聯(lián)合用藥組（阿托伐他汀 5 mg·kg-1·d-1+硝苯地平5 mg·kg-1·d-1）。除正常組外，其余四組連續(xù)灌胃15 d后，經(jīng)鼠尾靜脈注入垂體后葉素1.5 U/kg，誘發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣。應(yīng)用透射電鏡觀察大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；應(yīng)用Western Blot方法測(cè)定大鼠冠狀動(dòng)脈細(xì)胞膜RhoA蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞漿RhoA蛋白表達(dá)水平，以細(xì)胞膜RhoA與細(xì)胞漿RhoA比值表示RhoA活性，比較各組大鼠冠狀動(dòng)脈RhoA活性。結(jié)果 ①心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：對(duì)照組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)明顯破壞；硝苯地平組及阿托伐他汀組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的破壞程度較對(duì)照組明顯減輕；聯(lián)合用藥組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯破壞。②冠狀動(dòng)脈RhoA活性：與正常組相比，對(duì)照組冠狀動(dòng)脈RhoA活性明顯升高（2.55±0.15比 0.81±0.16，P＜0.01）；與對(duì)照組相比，阿托伐他汀組冠狀動(dòng)脈 RhoA 活性明顯減低（0.99±0.34比 2.55±0.15，P＜0.01），硝苯地平組冠狀動(dòng)脈 RhoA 活性未見(jiàn)明顯改變（2.21±0.23比 2.55±0.15，P=0.08），聯(lián)合用藥組冠狀動(dòng)脈RhoA活性明顯減低（1.13±0.42比2.55±0.15，P＜0.01）。結(jié)論 阿托伐他汀預(yù)處理能有效預(yù)防垂體后葉素誘發(fā)大鼠冠狀動(dòng)脈痙攣，保護(hù)心肌細(xì)胞，與硝苯地平聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的活性參與阿托伐他汀預(yù)防冠狀動(dòng)脈痙攣，保護(hù)心肌細(xì)胞。

阿托伐他?。?冠脈痙攣； RhoA活性

阿托伐他汀是強(qiáng)有效的降膽固醇藥物，在臨床上廣泛應(yīng)用于冠心病的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防[1]。近來(lái)他汀類藥物獨(dú)立于降脂作用的心血管益處（多效性）被廣泛關(guān)注[2,3]，包括抑制血管平滑肌增生、改善內(nèi)皮功能障礙、減少血小板聚集和穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊等[4]。既往研究[5]表明，他汀類藥物的多效性是通過(guò)抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路。體外及臨床研究[6,7]表明，他汀類藥物有預(yù)防冠脈痙攣的作用。但有關(guān)他汀預(yù)防冠脈痙攣的機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)垂體后葉素誘發(fā)大鼠冠狀動(dòng)脈痙攣，探討阿托伐他汀預(yù)處理能否預(yù)防冠狀動(dòng)脈痙攣造成的心肌損害，以及對(duì)大鼠冠狀動(dòng)脈RhoA活性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 阿托伐他?。ㄝx瑞公司）；垂體后葉素（上海第一生化藥業(yè)有限公司）；硝苯地平（山西云鵬制藥有限公司）；水合氯醛（上海生工）；一抗為兔抗大鼠多克隆RhoA抗體（1∶200，santa cruz，美國(guó)）；GAPDH（1∶750，Bioworld，美國(guó)）；二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶1000，Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），膜蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒（凱基生物，中國(guó)）；Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒（凱基生物，中國(guó)）；ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（凱基生物，中國(guó)）；Western電泳及轉(zhuǎn)膜裝置（Bio-Rad公司，美國(guó)）；凝膠成像系統(tǒng)（Gene公司，英國(guó)）；JEM-2000EX透射電鏡（JEOL公司，日本）

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 9～10周健康雄性SD大鼠50只，體重300～350 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為5組，每組10只。①正常組：不給予藥物干預(yù)。②對(duì)照組：生理鹽水每日灌胃1次。③阿托伐他汀組：5 mg/kg，每日灌胃1次。④硝苯地平組：5 mg/kg，每日灌胃1次。⑤聯(lián)合用藥組：阿托伐他汀5 mg/kg+硝苯地平5 mg/kg，每日灌胃1次。20 mg阿托伐他汀（10 mg/片）磨成粉末狀，10 ml生理鹽水中混勻。20 mg硝苯地平（10 mg/片）磨成粉末狀，10 ml生理鹽水中混勻。每日上午8～10點(diǎn)給藥，持續(xù)15 d。

1.3 冠狀動(dòng)脈痙攣誘發(fā)實(shí)驗(yàn) 除正常組外，其余四組（對(duì)照組、阿托伐他汀組、硝苯地平組及聯(lián)合用藥組）連續(xù)灌胃15 d后均給予垂體后葉素誘發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣。步驟如下：10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300～350 mg/kg），大鼠麻醉后仰位固定于鼠板，于鼠尾靜脈注射垂體后葉素1.5 U/kg（10 s內(nèi)推完），誘發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣。30 min后，剖胸，取冠狀動(dòng)脈裝于冷凍管中，-80℃冰箱冷凍保存，用于免疫印跡（Western blot）檢測(cè)；取心尖部組織，在2.5%戊二醛中切成約1 mm3的小塊，放置于2.5%戊二醛中4℃保存。

1.4 超微結(jié)構(gòu)觀察 2.5%戊二醛固定大鼠心尖部心肌組織，常規(guī)電鏡樣品包埋，超薄切片，鈾、鉛雙重染色，透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)變化并攝影。

1.5 RhoA活性測(cè)定 用Western Blot測(cè)定大鼠冠狀動(dòng)脈細(xì)胞膜RhoA與細(xì)胞漿RhoA的蛋白表達(dá)水平，以細(xì)胞膜RhoA蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞漿RhoA蛋白表達(dá)水平的比值表示RhoA活性。一抗：兔抗大鼠多克隆RhoA抗體，稀釋濃度為1∶200。二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，稀釋濃度為1∶1000。內(nèi)參：GAPDH，稀釋濃度為1∶750。根據(jù)膜蛋白胞漿蛋白提取試劑盒說(shuō)明書，分別提取胞漿蛋白和胞膜蛋白。采取Bradford法進(jìn)行蛋白定量，等量樣品經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶中4℃封閉過(guò)夜，分別加入兔抗大鼠RhoA多克隆抗體和兔抗大鼠 GAPDH抗體，室溫?fù)u床孵育3 h。膜漂洗后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，酶法顯色，掃描。采用 Image J圖像分析系統(tǒng)分析細(xì)胞膜RhoA和細(xì)胞漿RhoA灰度值，選取3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 正常組：肌絲排列整齊，形態(tài)完好，肌節(jié)結(jié)構(gòu)完好；肌絲間線粒體排列整齊，形態(tài)正常，界膜完整，嵴無(wú)斷裂。對(duì)照組：心肌超微結(jié)構(gòu)破壞明顯，肌絲排列紊亂，肌節(jié)消失；肌絲間線粒體成堆聚集、腫脹；大部分線粒體局部膜破裂，嵴降解。硝苯地平組：較對(duì)照組明顯好轉(zhuǎn)，肌絲排列不規(guī)則，肌節(jié)結(jié)構(gòu)完好；部分線粒體增生、腫大，形態(tài)有變形，但界膜完整，嵴清晰。 阿托伐他汀組：較對(duì)照組明顯好轉(zhuǎn)，肌絲排列不規(guī)則，肌節(jié)結(jié)構(gòu)完好；線粒體有小部分融合，余形態(tài)正常，嵴清晰。聯(lián)合用藥組：心肌超微結(jié)構(gòu)接近正常，未見(jiàn)明確形態(tài)學(xué)改變。見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠冠狀動(dòng)脈RhoA活性的改變 與正常組比較，對(duì)照組大鼠冠狀動(dòng)脈RhoA活性明顯升高（2.55±0.15 比 0.81±0.16，P＜0.01）。與對(duì)照組比較，硝苯地平組大鼠冠狀動(dòng)脈RhoA活性未見(jiàn)明顯改變（2.21±0.23 比 2.55±0.15，P=0.08）；阿托伐他汀組大鼠冠狀動(dòng)脈RhoA活性明顯減低（0.99±0.34比2.55±0.15，P＜0.01）；聯(lián)合用藥組大鼠冠狀動(dòng)脈RhoA 活性明顯減低（1.13±0.42比 2.55±0.15，P＜0.01）。見(jiàn)圖 2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鼠尾靜脈注射垂體后葉素能誘發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣，導(dǎo)致心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞伴有血管平滑肌細(xì)胞RhoA激活。阿托伐他汀預(yù)處理能有效保護(hù)心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，預(yù)防RhoA激活。

靜脈注射垂體后葉素是誘導(dǎo)大鼠急性心肌缺血常用的經(jīng)典模型[8]。本實(shí)驗(yàn)的前期研究證實(shí)，垂體后葉素誘發(fā)大鼠冠狀動(dòng)脈痙攣引起缺血性心電圖改變[9]。垂體后葉素誘發(fā)大鼠冠狀動(dòng)脈痙攣，造成心肌急性缺血缺氧損傷。心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變是反映細(xì)胞損傷最直觀的指標(biāo)。線粒體是維持細(xì)胞氧及能量代謝等的重要功能單位，故對(duì)缺氧十分敏感，是反映心肌細(xì)胞損傷的敏感指標(biāo)[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)鼠尾靜脈注射垂體后葉素誘發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣，電鏡下可見(jiàn)心肌超微結(jié)構(gòu)破壞明顯，肌絲排列紊亂，肌節(jié)消失；肌絲間線粒體成堆聚集、腫脹；大部分線粒體局部膜破裂，嵴降解，與既往研究結(jié)果一致[11]。預(yù)防性應(yīng)用阿托伐他汀能明顯減輕大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的破壞：肌絲排列好轉(zhuǎn)，肌節(jié)結(jié)構(gòu)完好，線粒體僅有小部分融合，嵴清晰，與傳統(tǒng)預(yù)防冠脈痙攣的鈣通道阻滯劑硝苯地平作用效果相似，提示阿托伐他汀和硝苯地平一樣能有效預(yù)防冠狀動(dòng)脈痙攣、保護(hù)心肌細(xì)胞。阿托伐他汀和硝苯地平聯(lián)合應(yīng)用效果優(yōu)于兩藥單獨(dú)應(yīng)用，能更好地預(yù)防垂體后葉素誘發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣所致大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)破壞，提示阿托伐他汀和硝苯地平通過(guò)不同途徑預(yù)防冠狀動(dòng)脈痙攣，兩者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用。

血管平滑肌收縮增強(qiáng)是冠狀動(dòng)脈痙攣的主要發(fā)病機(jī)制之一[12]。血管平滑肌細(xì)胞的收縮由細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及收縮器對(duì)鈣離子的敏感性調(diào)節(jié)。介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞鈣離子敏感性增加的主要是肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶（myosin light chain phosphatase，MLCP）的抑制。RhoA/Rho激酶信號(hào)通路激活，通過(guò)磷酸化MLCP的肌球蛋白結(jié)合亞單位抑制MLCP活性增強(qiáng)血管平滑肌細(xì)胞對(duì)鈣離子的敏感性，在冠脈痙攣的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[14]及臨床研究[15]均表明，冠狀動(dòng)脈痙攣時(shí)RhoA/Rho激酶信號(hào)通路活性增強(qiáng)。臨床研究[16]表明，Rho激酶抑制劑能有效抑制冠狀動(dòng)脈痙攣。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)垂體后葉素誘發(fā)大鼠冠狀動(dòng)脈痙攣發(fā)現(xiàn)，與正常組大鼠相比，對(duì)照組大鼠冠狀動(dòng)脈RhoA活性明顯升高，說(shuō)明垂體后葉素誘發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣的同時(shí)伴有冠狀動(dòng)脈RhoA激活，提示血管平滑肌細(xì)胞RhoA/Rho激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路激活參與垂體后葉素誘發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣的發(fā)病機(jī)制。

膽固醇合成的中間產(chǎn)物類異戊二烯介質(zhì)是小G蛋白家族包括RhoA激活的必要物質(zhì)基礎(chǔ)。這些類異戊二烯介質(zhì)與RhoA的羧基末端相連，增加RhoA的親脂性（異戊烯化），促使其定位在細(xì)胞膜上而激活，進(jìn)而激活下游效應(yīng)蛋白R(shí)ho激酶，發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。阿托伐他汀抑制HMG-CoA還原酶在減少膽固醇合成的同時(shí)減少類異戊二烯介質(zhì)的合成，抑制RhoA的異戊烯化[15]，從而抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性。Rattan的實(shí)驗(yàn)[17]發(fā)現(xiàn)，他汀通過(guò)抑制RhoA從胞漿轉(zhuǎn)移到胞膜，進(jìn)而抑制RhoA活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，垂體后葉素誘發(fā)大鼠冠狀動(dòng)脈痙攣的同時(shí)伴有冠狀動(dòng)脈RhoA活性升高，阿托伐他汀組及聯(lián)合用藥組大鼠冠狀動(dòng)脈RhoA活性明顯低于對(duì)照組大鼠，證實(shí)預(yù)防性應(yīng)用阿托伐他汀能夠抑制大鼠冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞RhoA激活。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)，他汀類藥物具有預(yù)防冠狀動(dòng)脈痙攣的作用[6,7]。綜上推測(cè)，抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路活性和抑制冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的鈣離子敏感性，是阿托伐他汀預(yù)防垂體后葉素誘發(fā)大鼠冠狀動(dòng)脈痙攣、保護(hù)心肌細(xì)胞的重要機(jī)制。

冠狀動(dòng)脈痙攣是眾多缺血性心臟病包括變異型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死及猝死的基本發(fā)病機(jī)制之一。鈣通道阻滯劑是目前治療冠狀動(dòng)脈痙攣基礎(chǔ)用藥及經(jīng)典用藥[18]。鈣通道阻滯劑主要通過(guò)阻斷鈣離子內(nèi)流、降低血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，使冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張。然而，臨床實(shí)踐中40%的患者單用鈣通道阻滯劑仍不能完全控制冠狀動(dòng)脈痙攣[19]。他汀類藥物與鈣通道阻滯劑聯(lián)用通過(guò)不同途徑降低冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的收縮性，具有更好的預(yù)防冠狀動(dòng)脈痙攣的作用，為防治臨床冠狀動(dòng)脈痙攣提供更多的選擇。

阿托伐他汀預(yù)處理能有效預(yù)防垂體后葉素誘發(fā)大鼠冠狀動(dòng)脈痙攣，保護(hù)心肌細(xì)胞，與硝苯地平聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用；同時(shí)還具有抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的活性參與阿托伐他汀預(yù)防冠狀動(dòng)脈痙攣、保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

（本文圖片封三）

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The effects of Atorvastatin on myocardial ultrastructure and RhoA activity in rats with coronary artery spasm

SU Lin-bo，XIE Lian-na，WANG Kai-jun，et al.Department of Circulation，Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian 116001，China

Objective The present study was undertaken to investigate the protective effects and mechanisms of Atorvastatin on pituitrin-induced coronary artery spasm in rats.Methods Fifty male SD rats were randomly assigned to five groups（n=10）：normal group（no any intervention），control group（saline），Atorvastatin group （5 mg·kg-1·d-1），Nifedipine group （5 mg·kg-1·d-1） and combined group （Atorvastatin 5 mg·kg-1·d-1and Nifedipine 5 mg·kg-1·d-1）.After 15 days of treatment by intragastric administration （except the normal group），coronary artery spasm was induced by injecting pituitrin（1.5 U/kg）through caudal vein.The ultrastructure of myocardial tissue was observed by electron microscopy.The membrane RhoA protein expression and cytosolic RhoA protein expression of coronary artery tissue was detected by western blot，and RhoA activity was expressed as the ratio of membrane RhoA protein and cytosolic RhoA protein.Results ⑴Pituitrin-induced coronary artery spasm caused the acute myocardial ischemic/anoxic injury，which result in myocardial ultrastructure damage.Prophylactic use Atorvastatin had a protective role in coronary artery spasm induced myocardial ultrastructure damage，and combined with Nifedipine was more effective.⑵Compared with the normal group，coronary artery RhoA activity in the control group was significantly increased（2.55±0.15 vs 0.81±0.16，P＜0.01）.Compared with the control group，coronary artery RhoA activity was significantly decreased in the Atorvastatin group（0.99±0.34 vs 2.55±0.15，P＜0.01），no statistically difference in the Nifedipine group（2.21±0.23 vs 2.55±0.15，P=0.08），and significantly decreased in the combined group（1.13±0.42 vs 2.55±0.15，P＜0.01）.Conclusion Atorvastatin could effectively prevent pituitrin-induced coronary artery spasm，and had protective effect on myocardial ultrastructure in rats.The addition of Atorvastatin to Nifedipine had synergistic effect.Inhibition of RhoA/Rho-kinase pathway involve in the mechanism of Atorvastatin preventing coronary artery spasm.

Atorvastatin； Coronary artery spasm； RhoA activity

XIE Lian-na，E-mail：xieln1963@163.com

116001 遼寧省大連市，大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院循環(huán)科

謝蓮娜，E-mail：xieln1963@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．11．024

Q95-33；R541.4

A

1672-5301（2016）11-1052-04

2016-04-19）