HPLC法測(cè)定天仙子?xùn)|莨菪堿和莨菪堿的含量

李巖1， 孟慶勇1， 趙欣1， 孫婷1， 李曉靜1,2， 程雪梅2， 王長(zhǎng)虹2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑物化教研室， 烏魯木齊830011；2上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所；中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；

中藥新資源與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)綜合評(píng)價(jià)國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室; 上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海201210)

摘要：目的建立天仙子藥材中東莨菪堿和莨菪堿的高效液相測(cè)定方法。方法采用Symmetrix ODS-H色譜柱，以乙腈-0.1%三氟乙酸水(14∶86)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速1.0 mL/min，測(cè)定天仙子藥材中東莨菪堿和莨菪堿的含量。結(jié)果氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的線(xiàn)性范圍分別為4.02～513.64 μg/mL (r=0.999 9)和4.00～512.00 μg/mL (r=0.999 8)，平均回收率分別為98.41%和98.79%。結(jié)論HPLC法測(cè)定準(zhǔn)確、可控，能快速、簡(jiǎn)便地控制天仙子藥材的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：天仙子； 莨菪堿； 東莨菪堿； 高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：R917文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.016

[收稿日期：2014-9-12]

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81160137)；新疆維吾爾自治區(qū)教育廳青年教師科研培育基金(XJEDU2011S23)

作者簡(jiǎn)介：李莉(1987-)，女，在讀碩士，研究方向：微量元素與健康。

Determination of total alkaloids from Hyoscyami semen by HPLC

LI Yan1, MENG Qingyong1, ZHAO Xin1, SUN Ting1, LI Xiaojing1,2, CHENG Xuemei2, WANG Changhong2

(1DepartmentofPharmaceutics,CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011China；2InstituteofChineseMateriaMedica,ShanghaiUniversityofTraditional

ChineseMedicine;TheMOEKeyLaboratoryforStandardizationofChineseMedicinesand

TheSATCMKeyLaboratoryforNewResourcesandQualityEvaluationofChineseMedicines;

ShanghaiKeyLaboratoryofTCMComplexPrescription,Shanghai201210,China)

Abstract:ObjectiveTo establish quality control methods for determining active ingredients of the total alkaloids from Hyoscyami semen. MethodsThe determination of scopolamine and hyoscyamine in H. semen was performed on Symmetrix ODS-H column and mobile phase consisted of acetonitrile -0.1% trifluoroacetic acid (14∶86). The flow rate was 1.0 mL/min and the UV detective wavelength was set at 210 nm. ResultsThe linear ranges of scopolamine and hyoscyamine were 4.02-513.64 μg/mL (r=0.999 9) and 4.00-512.00 μg/mL (r=0.999 8), and the average recoveries were 98.41% and 98.79% respectively. ConclusionThe method could be easily used to evaluate the quality of H. semen, quick, accurate and controllable.

Key words：Hyoscyamisemen; hyoscyamine; scopolamine; HPLC

天仙子為茄科(Solanaceae)植物莨菪(Hyoscyamus niger L.)的干燥成熟種子，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。天仙子性溫，味苦辛，有毒，具有定癇、止痛的功效，常用于治療癲狂、風(fēng)痹厥痛、惡瘡等癥[1]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從天仙子的莖葉及種子中分離出近百種化合物，包括生物堿類(lèi)、多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、香豆素類(lèi)、木脂素酰胺類(lèi)、甾族皂甙類(lèi)等化合物[2-7]。其中托烷類(lèi)生物堿(主要為莨菪堿和東莨菪堿)被認(rèn)為是天仙子發(fā)揮治療神經(jīng)系統(tǒng)作用相關(guān)疾病的有效成分。目前的研究中有關(guān)天仙子的定量測(cè)定以HPLC法為主，2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》中，HPLC法測(cè)定天仙子藥材中阿托品和東莨菪堿含量的色譜條件中流動(dòng)相組成極其復(fù)雜。本研究采用以乙腈-0.1%三氟乙酸(14∶86)為流動(dòng)相，對(duì)東莨菪堿和阿托品的分離效果良好，以此建立了更為簡(jiǎn)易的HPLC含量測(cè)定方法，為藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters 2695-2998型高效液相色譜儀(Waters Co.)，DKZ-2系列電熱恒溫振蕩水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，MDF1-100手提式中藥粉碎機(jī)(上海民德機(jī)械制造有限公司)，N-1001 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，5415R離心機(jī) (Eppendorf，德國(guó))， BS/BT電子天平( 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，分析色譜柱Symmetrix ODS-H(4.6 mm×250 mm，5μm)，超純水器( Millipore公司)。

天仙子(批號(hào)：20120510-1、20120510-2、20120510-3，安徽德昌藥業(yè)飲片有限公司提供，產(chǎn)地：新疆)，由吳立宏副研究員(上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心)鑒定為茄科植物天仙子的(Hyoscyamus niger L.)的干燥種子；氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100050-200309)，硫酸阿托品(Sigma-Aldrich，批號(hào)：077K1047)，乙腈 (色譜純，F(xiàn)isher)，甲醇 (色譜純，F(xiàn)isher)，乙醇為工業(yè)級(jí)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備分別精密稱(chēng)取氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品對(duì)照25.08、25.00 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得含氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品對(duì)照品濃度分別為1.003和1.000 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2供試品溶液的制備參照2010版《中華人民共和國(guó)藥典》[8]測(cè)定天仙子藥材的含量測(cè)定方法，制備天仙子的供試品溶液。

2.3色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜柱Symmetrix ODS-H (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相:乙腈-0.1%三氟乙酸 (14∶86)；檢測(cè)波長(zhǎng)λ為210 nm；流速:1.0 mL/min；柱溫: 30℃；進(jìn)樣量:20 μL。在此條件下，氫溴酸東莨菪堿、硫酸阿托品與樣品中其他成分達(dá)到基線(xiàn)分離(圖1)。

2.4線(xiàn)性關(guān)系的考察精密量取“2.1”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.04、0.06、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12 mL,分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液20 μL注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定并記錄色譜圖，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸。氫溴酸東莨菪堿的線(xiàn)性回歸方程為: Y=20 570X+20 934，r=0.999 9(n=8)；硫酸阿托品的線(xiàn)性回歸方程為: Y=23 612X+59 928，r=0.999 7(n=8)。氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品分別在4.02～513.64 μg/mL和4.00～512.00 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

1：氫溴酸東莨菪堿；2：硫酸阿托品

2.5最低檢測(cè)限將混合對(duì)照品儲(chǔ)備液按逐步稀釋法稀釋?zhuān)旁氡燃s為3∶1時(shí)，氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的最低檢測(cè)限分別為2.5 μg/mL和2.0 μg/mL。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、48 h測(cè)定，計(jì)算氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的含量及RSD%，結(jié)果氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的RSD%分別為1.41% 和1.61%。

2.7精密度試驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0 mL分別置于10 mL量瓶中，純化水定容。于1 d內(nèi)測(cè)定5次,計(jì)算日內(nèi)精密度RSD(%)；連續(xù)測(cè)定3 d，進(jìn)行日間精密度測(cè)試，結(jié)果氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的日內(nèi)、日間精密度RSD均<2.0%，說(shuō)明日內(nèi)、日間精密度良好。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品，按供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，計(jì)算東莨菪堿、莨菪堿的含量(注：東莨菪堿含量=氫溴酸東莨菪堿含量×0.789;莨菪堿含量=硫酸阿托品的含量×0.855)及RSD(%)，結(jié)果東莨菪堿、莨菪堿的RSD分別為1.40%、1.51%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)取已測(cè)定準(zhǔn)確含量的天仙子藥材粉末約1.0 g，共9份，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入各對(duì)照品溶液適量，按供試品溶液的制備方法處理，測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。氫溴酸東莨菪堿和硫酸阿托品的高、中、低3個(gè)濃度的加樣回收率均在98%～120%范圍內(nèi)，RSD<2.0%。

表1　回收率測(cè)定結(jié)果( ±s)

表1　回收率測(cè)定結(jié)果( ±s)

加入量/μg測(cè)得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%氫溴酸東莨菪堿102.72232.2697.73±2.00128.41252.6898.74±2.2398.41±1.891.92154.09284.0998.76±1.96硫酸阿托品171.52386.2999.64±2.29215.04427.3798.57±2.2398.79±1.971.99256.00466.7398.15±1.89

2.10樣品含量測(cè)定將3批天仙子藥材按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣20 μL測(cè)定，記錄各個(gè)峰面積，分別計(jì)算天仙子中莨菪堿和東莨菪堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。3批天仙子藥材中東莨菪堿的含量在0.01%左右，莨菪堿的含量在0.02%左右。

表2　樣品含量測(cè)定結(jié)果( ±s)

表2　樣品含量測(cè)定結(jié)果( ±s)

成分批號(hào)樣品含量/%RSD/%20120510-10.0104±0.00021.92氫溴酸東莨菪堿20120510-20.0101±0.00021.9820120510-30.0103±0.00032.9120120510-10.0184±0.00021.09硫酸阿托品20120510-20.0171±0.00021.1720120510-30.0199±0.00021.00

3討論

目前有關(guān)托烷類(lèi)生物堿的含量測(cè)定方法主要有紫外分光光度法[9]、薄層色譜法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、離子對(duì)色譜發(fā)法[12]、HPLC法[13]等。對(duì)天仙子藥材中托烷類(lèi)生物堿的含量測(cè)定方法多以《中華人民共和國(guó)藥典》中HPLC測(cè)定方法為主，2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》中HPLC法測(cè)定天仙子藥材中阿托品和東莨菪堿含量的色譜條件為：甲醇-乙腈-30 mmol/L醋酸鈉緩沖液(含0.02%三乙胺、0.3% 四氫呋喃，用冰醋酸調(diào)pH值至6.0) (10∶5∶85)，其流動(dòng)相組成極其復(fù)雜。本研究嘗試了不同的流動(dòng)相組成，發(fā)現(xiàn)阿托品和東莨菪堿對(duì)酸性流動(dòng)相比較敏感，其中以乙腈-0.1%三氟乙酸(14∶86)為流動(dòng)相，對(duì)東莨菪堿和阿托品的分離效果良好，以此建立了更為簡(jiǎn)易的HPLC含測(cè)方法。

托烷類(lèi)生物堿也存在于洋金花和曼陀羅等植物中，并不是天仙子藥材中的專(zhuān)屬指標(biāo)成分。因此，今后應(yīng)該尋找天仙子中更專(zhuān)屬的活性成分作為質(zhì)控的指標(biāo)，以提高和完善《中華人民共和國(guó)藥典》的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)3批不同來(lái)源的天仙子藥材中托烷類(lèi)生物堿(莨菪堿和東莨菪堿合計(jì))的含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其含量較低，僅為0.03%左右，原因有待進(jìn)一步研究。但目前結(jié)果提示今后可從生產(chǎn)環(huán)節(jié)和資源建設(shè)著手，響應(yīng)醫(yī)藥工業(yè)“十二五”規(guī)劃對(duì)藥材原料規(guī)范化、規(guī)?；?、集約化的要求，逐步提高藥材的品質(zhì)。

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(本文編輯施洋)

通信作者：楊曉燕，女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：微量元素與健康，E-mail：390068143@qq.com。

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