固相萃取-UPLC-MS/MS法建立大鼠血漿中蒜氨酸含量測定方法

李博， 李新霞

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊830011)

摘要：目的建立基于UPLC-MS/MS與固相萃取(SPE)相結(jié)合的大鼠血漿中蒜氨酸的分析方法。方法用強陽離子基質(zhì)的SPE柱提取大鼠血漿中的蒜氨酸和降低基質(zhì)效應(yīng)，UPLC-MS/MS法進(jìn)行測定。結(jié)果對SPE方法中淋洗液和洗脫液進(jìn)行優(yōu)化，選擇水為淋洗液，甲醇-氨水(95∶5)為洗脫液，回收率>68%；蒜氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r2>0.99；蒜氨酸測定的日內(nèi)精密度和日間精密度良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)分別低于2.1和8.2。結(jié)論本方法可有效降低復(fù)雜生物樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，測定方法準(zhǔn)確、可靠，具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：蒜氨酸； 固相萃?。?UPLC-MS/MS

中圖分類號：R914文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.014

[收稿日期：2014-10-8]

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)科技計劃項目 (201130105-2)

作者簡介：王艷(1980-)，女，副教授，博士，研究方向：新疆地方藥用植物的研究。

作者簡介：熱娜˙卡斯木女,女(維吾爾族)，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：新疆特色中藥資源的開發(fā)與利用研究，E-mail:renakasimu@vip.sina.com。

Solid phase extraction-UPLC-MS/MS method to establish the determination

method of alliin content in rat plasma

LI Bo, LI Xinxia

(CollegeofFarmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo establish an analysis method of alliin in rat plasma based on UPLC/MS/MS in combination with solid phase extraction (SPE). MethodsSPE column (strong) cationic matrix was used to extract alliin in rat plasma and to reduce the matrix effect, with UPLC/MS/MS method for determination. ResultsOptimize the eluent in SPE method and choose water as eluent, methanol-ammonia (95:5) as the eluent, with the recovery rate above 68%, the correlation coefficient of Alliin standard curve r2>0.99, good inter-and intra -day precision for the alliin determination, and the relative standard deviation (RSD) less than 2.07 and 2.07 respectively. ConclusionThis method is effective in reducing the matrix effect of complex biological samples, with accuracy, reliability and good application prospects.

Key words： Alliin； SPE； UPLC/MS/MS

大蒜(Allium sativum L．)為百合科蔥屬多年生草本植物，產(chǎn)于世界各地，富含大量的生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分，是公認(rèn)的藥食兩用珍品[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，大蒜具有殺菌、降血脂、抗血栓、預(yù)防中風(fēng)和高血壓、保護肝臟、提高機體免疫力及抗癌等功能[2-3]。大蒜中的功效成分是蒜酶催化裂解蒜氨酸的產(chǎn)物，了解蒜氨酸在血液等生物樣品中的處置決定了大蒜的活性制劑的合理科學(xué)應(yīng)用。本課題組在蒜氨酸測定方面相關(guān)研究已有很多年，在提取、分離、純化、制劑及分析方法等方面均取得了一定的成果[4-7]。建立合適的測定生物樣品中蒜氨酸的方法顯得尤為重要。

近年來，利用可揮發(fā)性的離子對試劑，快速、簡便、靈敏的超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI MS/MS)方法已用于復(fù)雜生物基質(zhì)(血漿或尿液)樣品的測定。與傳統(tǒng)的分析方法相比，UPLC-ESI MS/MS技術(shù)具有高特異性、高靈敏度和高通量的優(yōu)勢[8-9]。由于質(zhì)譜檢測的高選擇性，基質(zhì)效應(yīng)的影響在色譜圖上往往觀察不到，即空白基質(zhì)色譜圖表現(xiàn)為一條直線，但這些共流出組分會改變待測物的離子化效率，引起待測物檢測信號的抑制或提高，影響分析結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。固相萃取(SPE)能夠有效降低基質(zhì)效應(yīng)，尤其在測定低含量物質(zhì)時還具有預(yù)濃縮樣品待測成分的優(yōu)勢[9]。

本研究建立UPLC-MS/MS方法用于分析血漿中的蒜氨酸,并使用強陽離子交換固相萃取柱提取血漿中的氨基酸和降低基質(zhì)效應(yīng)，對分析方法的回收率、線性、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行考察。

1試藥與儀器

1.1藥品蒜氨酸對照品(GSB11-3079-2013，新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，批號：AL080430，含量≥99%)。

1.2試劑與儀器甲醇(色譜純,Fisher)，乙腈(色譜純,Fisher)，鹽酸(分析純,西安化學(xué)試劑廠)， 甲酸(分析純,天津富宇精細(xì)化工)， 乙酸銨(分析純,上海試四赫維化工)。WatersOasis@MCX小柱(Waters)，固相萃取儀(Waters)， WatersAcQuity超高效液相(Waters)， 質(zhì)譜Xevo TQ(Waters)。

2方法與結(jié)果

2.1溶液配置

2.1.1血漿的制備大鼠用乙醚麻醉，腹腔靜脈采血，肝素鋰抗凝，3 000 r/min離心10 min，取血漿。

2.1.2蒜氨酸對照品溶液的制備精密稱取蒜氨酸對照品10.10 mg于10 mL容量瓶中，水溶解并定容至刻度，搖勻，即得蒜氨酸對照品儲備溶液(C=1 010.0 μg/mL)。用水進(jìn)行倍比稀釋，得濃度分別為30.30、25.25、20.20、15.15、10.10、3.30、0.51 μg/mL蒜氨酸對照品溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

2.2血漿樣品的處理

2.2.1SPE預(yù)處理依次用1 mL甲醇和1 mL 2%甲酸溶液(pH 2)活化并平衡固相萃取小柱。

2.2.2供試品溶液制備取待處理樣品溶液300 μL，上樣，用水3 mL淋洗，保持正壓直至SPE柱床材料完全干燥；用1 mL的體積比為5/95的氨水-甲醇溶液分次洗脫；洗脫液以氮氣吹干，水復(fù)溶，上活化好的SPE柱，分別以水3 mL淋洗，吹干，以1 mL5%氨水-甲醇溶液洗脫，氮氣吹干，水定容至5 mL。

2.3血漿中蒜氨酸UPLC-MS-MS色譜分析方法建立色譜質(zhì)譜條件：色譜柱：Spursil C18 (100 mm×2.1 mm，3 μm)；流動相：0.1%甲酸-甲醇(95∶5)；流速：0.3 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子化(ESl)；毛細(xì)管電壓電壓1 000 V；毛細(xì)管溫度400℃；錐孔電壓：16 V；碰撞電壓：13 V；碰撞氣為氬氣，檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。專屬性試驗：分別取空白血漿、血漿中提取的蒜氨酸、蒜氨酸對照品，記錄色譜圖(圖1～5)。

圖1蒜氨酸對照水溶液色譜圖及總離子流

圖2蒜氨酸對照水溶液質(zhì)譜圖Parent Ions

圖3蒜氨酸對照水溶液質(zhì)譜圖Daughter Ions

圖4空白血漿總離子流圖

在所采用的色譜條件下，蒜氨酸峰形良好，無雜質(zhì)干擾峰影響測定。根據(jù)蒜氨酸斷裂的模式及機理選擇血漿中蒜氨酸的定性和定量離子對，選定正離子模式用于蒜氨酸的分析以獲得較高的靈敏度。將蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液直接注入質(zhì)譜進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，獲得其產(chǎn)物離子(或碎片離子)，產(chǎn)物離子與文獻(xiàn)比較一致。m/z為177.8/160.8時靈敏度最高，選定血漿中蒜氨酸的定量離子對。

2.3.1線性與范圍

2.3.1.1水溶液中蒜氨酸的線性考察將“2.1.2”項下蒜氨酸對照品溶液，制成一系列不同濃度的蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，UPLC-MS-MS法測定蒜氨酸，以峰面積(Y)對進(jìn)樣濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=7 250X-1 622.2(r=0.998 3)，表明蒜氨酸在0.101～30.30 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖5　血漿中提取的蒜氨酸總離子流圖

2.3.1.2血漿中蒜氨酸線性關(guān)系考察取“2.1.1”項下制備的血漿100 μL，加蒜氨酸對照儲備液，制成一系列不同濃度蒜氨酸的血漿溶液，分別加水100 μL ，照“2.2”項下方法制備，UPLC-MS-MS法測定，以峰面積(Y)對進(jìn)樣濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=5 247X-957.7(r= 0.999 0)，表明蒜氨酸在1.52～30.30 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2定量限與檢測限取蒜氨酸對照品貯備液逐級稀釋后，按照上述色譜條件進(jìn)樣測定，以S/N=10，測得蒜氨酸定量限為100 ng/mL；以S/N=3，測得蒜氨酸檢測限為10 ng/mL。

2.3.3精密度試驗取“2.3.1.2”項下制備的3.03、10.10、30.30 μg /mL 3種濃度蒜氨酸血漿提取溶液，分別進(jìn)樣5 μL，日內(nèi)連續(xù)測定5次，考察日內(nèi)精密度，連續(xù)測定5 d，考察日間精密度，得到低、中、高濃度的血漿提取樣品日內(nèi)RSD%分別為2.0、2.1和1.9；低、中、高濃度的血漿提取樣品日間RSD%分別為7.5、3.0和8.2，對于復(fù)雜的生物樣品來說日內(nèi)及日間精密度均良好。

2.3.4提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)考察

2.3.4.1提取回收率試驗分別精密取150、500、1 000 μg/mL的蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL于eppendorf離心管中，再分別加入100 μL大鼠血漿，加水100 μL，渦旋混合均勻。照“2.2”項下方法制備，測定，與相應(yīng)濃度蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)水溶液計算。結(jié)果表明上述提取方法蒜氨酸的回收率>63%，考慮到對于蒜氨酸的蛋白結(jié)合情況及血漿樣品的復(fù)雜性，回收率結(jié)果滿意。

2.3.4.2基質(zhì)效應(yīng)考察取“2.1.1”項下血漿,照“2.2”項下方法制備至吹干后，分別加入150、500、1 000 μg/mL的蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，加水定容至5 mL，測定，與相應(yīng)濃度蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)水溶液計算。結(jié)果在3個濃度水平的基質(zhì)回收率>95%，基本消除信號抑制現(xiàn)象。

3結(jié)論

本研究采用MCX-SPE的提取方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的直接上樣的方法，方法簡單，回收率較好，重現(xiàn)性好，有效地降低了復(fù)雜生物樣品中的基質(zhì)效應(yīng)。 UPLC-ESI MS/MS法測定蒜氨酸含量與傳統(tǒng)的分析方法相比有較高特異性、靈敏度，具有重要的應(yīng)用前景。本課題組今后還將對其他生物樣品(如腸吸收液、細(xì)胞提取液等)中的蒜氨酸提取進(jìn)行考察。本方法的建立對今后蒜氨酸的生物代謝研究提供了檢測方法。

參考文獻(xiàn):

[1]Makoto I, Nagatoshi I, Jiro Y,et al. Determination of Organosulfur Compounds in Garlic by High-Performance Liquid Chromatography[J]. J Agric Food Chen, 2006, 54:1535-1540.

[2]Uchida Y, Takahasbi T, Sato N.The characteristics of the antibacterial activity of garlic[J]. Jpn J Antibiot, 1975,28(4):638-642.

[3]Song K, Milner JA. Fleating garlic inhibits its ability to suppress 7, 12-dimethyl benz (a) anthracene-induced DNA adduct formation in rat mammary tissue[J]. J Nutr, 1999, 129(3):657-661.

[4]王巖，李新霞，陳堅．薄層掃描法測定大蒜中蒜氨酸的含量[J]．中國藥學(xué)雜質(zhì),2003,38(3)：217-218.

[5]常軍民，張麗靜，美麗萬．HPLC測定不同產(chǎn)地大蒜中蒜氨酸的含量[J]．中成藥,2004,26(12)：1025-1027.

[6]趙榮梅.鮮蒜、蒜氨酸、蒜酶定量分析方法與蒜氨酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].烏魯木齊：新疆醫(yī)科大學(xué)，2008：1-7.

[7]袁耀佐, 杭太俊, 紀(jì)宇, 等. 柱前衍生化反相高效液相色譜法測定大蒜中的蒜氨酸及其有關(guān)物質(zhì)[J]. 色譜, 2008, 26(2):242-245.

[8]van Eeckhaut A，Lanckmans K，Sarre S，et al．Validation of bioanalytical LC-MS/MS assays:evaluation of matrix effects[J].J Chromatogr B，2009，877(23)：2198.

[9]湯新星，顧源，蔡尚 等. 固相萃取-高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析大鼠血漿中的氨基酸及其在電離輻射損傷動物模型中的應(yīng)用[J].色譜,2012,30(7):696-704.

(本文編輯施洋)