健康婦女陰道乳桿菌的分離鑒定

武香玉，徐海燕，辛國芹，趙影，谷巍

(山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東 泰安 271000)

摘要：目的以健康婦女陰道分泌物為分離源分離乳桿菌，尋求陰道優(yōu)勢乳桿菌，為治療細菌性陰道疾病提供菌株基礎(chǔ)。方法采用傳統(tǒng)方法分離鑒定乳桿菌，篩選能產(chǎn)生過氧化氫的優(yōu)勢菌株，并用16SrRNA序列分析方法進行分子鑒定。并驗證了其抑菌試驗效果。結(jié)果從健康婦女陰道中分離到9種乳酸桿菌種屬，主要有卷曲乳桿菌，格式乳桿菌，詹氏乳桿菌等，其他也有羅伊氏乳桿菌，約氏乳桿菌，嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌。大多數(shù)乳桿菌都能產(chǎn)過氧化氫，且對病原微生物有一定的抑制作用。 結(jié)論卷曲乳桿菌，格式乳桿菌，詹氏乳桿菌等是婦女陰道內(nèi)主要的乳桿菌種類，能產(chǎn)過氧化氫，并可以抑制病原菌生長。

關(guān)鍵詞：陰道分泌物；乳酸桿菌；分離鑒定；過氧化氫

作者簡介：武香玉，女，研究方向：微生物學，E-mail:wxy0601@163.com

中圖分類號：R378.99+2文獻標識碼：A

Isolation and identification oflactobacillusfrom healthy women′s vaginas

WUXiang-yu,XUHai-yan,XINGuo-qin,ZHAOYing,GUWei

(ShandongBaolai-leelaiBioengineeringCo.,Ltd.,Taian271000,China)

Abstract：ObjectiveTo isolate lactobacillus from healthy female Vaginal Secretions,seek the advantage lactobacillus and provide a basis for treating bacterial strains vaginal disease.MethodsUsing traditional morphology analysis to identify lactobacillus.Screening for hydrogen peroxide-producing lactobacillus．Applying 16SrRNA sequence analysis molecular biology methods to identify it exactly.And had confirmed its bacteriostasis experiment effect.ResultsL.gasseri,L.crispatus,L.jensenii were the major species isolated from the healthy women,and the other types included L.johnsonii,L.acidophilus and L.fermentum.Most of these lactobacilli can produce hydrogen peroxide,and also had certain inhibitory action to the pathogenic microorganism.ConclusionL.crispatus,L.jensenii and L.gasseri were predominant species in the vagina of healthy Chinese women and can produce hydrogen peroxide.They had certain inhibitory action to the pathogenic microorganism.

Key words:Vaginal Secretions;Lactobacillus;Isolation and identification;Hydrogen peroxide

乳酸桿菌(Lactobacillusspp.)是婦女陰道微生態(tài)菌群的優(yōu)勢菌，對維持陰道微生態(tài)的平衡起重要作用。特別是能產(chǎn)生H2O2的乳桿菌，可以抑制其他細菌的生長，從而保護陰道健康。本研究通過采集健康育齡婦女陰道分泌物分離純化乳桿菌，并對其進行鑒定，從而了解陰道中主要的乳桿菌種類，并分析其產(chǎn)過氧化氫的能力，為微生態(tài)方法治療細菌性陰道疾病提供菌株和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1分離源陰道分泌物。

1.2培養(yǎng)基改良MRS培養(yǎng)基[1](菌株分離時培養(yǎng)基中添加1%的碳酸鈣);H2O2鑒定MRS培養(yǎng)基[2]：MRS瓊脂培養(yǎng)基中包含0.25 mg·mL-1的四甲基聯(lián)苯胺、0.l mg·mL-1的辣根過氧化物酶。

2試驗方法

2.1陰道分泌物的采集[3,4]泰安市88醫(yī)院婦科體檢處醫(yī)生協(xié)助取樣，用無菌棉拭子于陰道后1/3處一次性順時針刮抹，須避免接觸到外陰部和陰道口以防污染。取出后立即放至MRS液體培養(yǎng)基中，并編號記錄。

2.2菌株的分離純化及鑒定[5]將采樣試管置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取富集培養(yǎng)后的菌液依次稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5,各稀釋度取0.1 mL涂平板(MRS+CaCO3)，2個重復，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)基上具有明顯鈣溶圈的菌落于斜面，革蘭染色、鏡檢，直至確定為純菌，將純化后的乳桿菌菌株接種到MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)后，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3產(chǎn)酸性能的測定[6]將分離的菌種按照2%接種量接種于改良的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，測定發(fā)酵液的pH值。

2.4乳桿菌的初步鑒定凡是革蘭染色陽性，H2O2酶試驗陰性的菌株可初步確定為乳桿菌。

2.5乳桿菌屬的鑒定[7]通過生長溫度試驗(15、45 ℃)、運動性試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗對疑似菌株進行屬的鑒定。

2.6優(yōu)勢乳桿菌的篩選[8]應(yīng)用H2O2鑒定MRS培養(yǎng)基篩選產(chǎn)H2O2的乳桿菌。接種后放置37 ℃厭氧菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后將長好的菌落暴露于空氣中20 min，如果菌株能產(chǎn)H2O2，則這個菌的菌落會變藍。

2.716SrRNA分子鑒定[9~11]PCR擴增引物： 1492r：5′-ggttaccttgttacgactt-3′，27f:5′-agagttgatcctggctcag-3′。

菌落PCR反應(yīng)條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，25個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)salt-free純化后，PCR產(chǎn)物測序由博尚生物技術(shù)有限公司完成，要求雙向測通。將拼接后的序列結(jié)果輸入www.NCBI.nlm.nih.gov/blast，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比對。

2.8體外抑菌試驗對能產(chǎn)過氧化氫的菌株測定了體外抑菌作用[12]。

3結(jié)果與分析

3.1乳桿菌的分離和純化從采集的多份樣品中共分離純化出41株菌，并將其凍干保存。

3.2產(chǎn)酸性能的測定結(jié)果結(jié)果見表1。

表1　產(chǎn)酸性能的測定結(jié)果(測定20 h發(fā)酵液的pH值)

續(xù)表1：

菌種pH菌種pH菌種pHL-7-24.48大-5-33.72C2-6-104.39L-7-36.06大-7-73.91C2-6-13.98L-2-15.34大-7-43.76C2-6-114.33L-7-14.30大-1C2-5-44.27

由表1可見，所分菌株產(chǎn)酸性能尚可，部分菌株發(fā)酵液pH值低于4，大部分菌株pH值在4~5之間，5株菌的發(fā)酵液pH值高于5。

3.3乳桿菌屬的鑒定所分41株菌均為革蘭染色陽性，無芽孢，細長彎曲或球桿狀、桿狀，單個或成鏈。所有的菌均不運動，硝酸鹽還原反應(yīng)、H2O2酶試驗陰性，不液化明膠，不產(chǎn)吲哚和H2S，在15 ℃培養(yǎng)條件下所有乳桿菌都不生長。

3.4產(chǎn)過氧化氫菌株的測定通過優(yōu)勢乳桿菌的篩選，其中菌落變?yōu)樗{色能產(chǎn)H2O2的菌株有FNE-3、FND-4、FND-1等21株菌。

圖1　產(chǎn)H 2O 2菌落變?yōu)樗{色的菌

3.5分子鑒定結(jié)果結(jié)果見圖2、表2。

圖2　PCR電泳圖

將所得到的序列輸入www.NCBI.nlm.nih.gov/blast，與Genbank數(shù)據(jù)庫的序列作比對，進行同源性分析，得到最相似的物種名，登錄號及其相似率。根據(jù)BLAST比對的結(jié)果進行初步鑒定，然后篩選相關(guān)模式菌株的16S rRNA序列利用軟件MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的屬種(見表2)。

3.6體外抑菌試驗結(jié)果結(jié)果見表3。

由表3可見幾乎所有的菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑制作用，對變形桿菌和沙門氏菌的抑制效果不如對金黃色葡萄球菌和大腸肝菌效果好。

表2　FNE-3等菌株鑒定結(jié)果

表3　FNE-3等菌株的抑菌效果

4結(jié)論與討論

4.1從采集的多份樣品中共分離純化出41株菌并保存。

4.2對分離純化的菌株進行產(chǎn)酸測定，屬種鑒定及優(yōu)勢乳桿菌篩選試驗，對其中性能較好的菌株16SrRNA分子鑒定，共鑒定了21株菌，主要有卷曲乳桿菌，格氏乳桿菌，詹氏乳桿菌，羅伊氏乳桿菌，約式乳桿菌，嗜酸乳桿菌等。并對其驗證了抑菌效果，幾乎所有的菌對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑制作用，對變形桿菌和沙門氏菌的抑制效果不如對金黃色葡萄球菌和大腸肝菌效果好。

4.3細菌性陰道疾病是婦科疾病的常見病，主要特征是陰道中的乳酸桿菌減少，致病菌數(shù)量增多，因而導致整個微生態(tài)的失衡，影響婦女的身心健康。常用的抗生素治療容易破壞陰道菌群，導致病變反復發(fā)作和遷延不愈。而乳酸桿菌既可以抑制病原菌的生長，又對治療陰道感染有顯著的效果，調(diào)節(jié)陰道菌群平衡。因此我們從健康婦女陰道分泌物中分離乳酸桿菌，用以開發(fā)微生態(tài)活菌制劑，通過調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡進行扶正治療。

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