孟軍

摘 要：建立凝膠法檢查穿琥寧注射液細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。本實(shí)驗(yàn)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查應(yīng)用鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理進(jìn)行。選用靈敏度為0.5 EUmL-1的鱟試劑，并用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將穿琥寧注射液稀釋成1∶10濃度的稀釋液，進(jìn)行凝膠法反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該注射液中所含細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)鱟試劑反應(yīng)無干擾作用。同時(shí)將細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法與家兔法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，兩種方法測(cè)定結(jié)果相符。以上結(jié)果證明細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法可以代替家兔法檢測(cè)穿琥寧注射液的熱原。

關(guān)鍵詞：穿琥寧注射液 細(xì)菌內(nèi)毒素 凝膠法 鱟試劑 熱原

中圖分類號(hào)：R92 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2015）02（b）-0030-02

Gel Reaction Checking The Bacteria Endotoxin of Potassium Dehydroandrograpolide Succinate Injection

Meng jun

（The Institute of Food and Drug Contro，Tonghua Jilin，134001，China）

Abstract：The method of the determination about the bacteria endotoxin has been established for Potassium Dehydroandrograpolide Succinate injection.The checking of bacteria endotoxin was carried out based on the principle of agglomerate reaction between limulus reagent and bacteria endotoxin.In this experiment，Limulus reagent was selected at sensitivity 0.5EU·mL-1，and Potassium Dehydroandrograpolide Succinate injection was diluted to ten times with the water used for the checking of bacteria endotoxin， then the gel reaction was performed. The results of the experiments indicate that the bacteria endotoxin contained in the injection have no observed interfering with Limulus reagent.Compared with the results determined by cattle rabbit method， the two methods show same results.These results verify that the method of the bacteria endotoxin determination may replace cattle rabbit method to check Potassium Dehydroandrograpolide Succinate injection heating source.

Key Words：Potassium Dehydroandrograpolide Succinate Injection； Bacteria Endotoxin； Limulus Reagent；Heating Source

穿琥寧注射液具有較強(qiáng)的解熱作用，對(duì)流感病毒甲Ⅰ型、甲Ⅲ型、肺炎腺病毒均有滅活作用，主要與抗生素聯(lián)合用藥治療病毒性感染，在臨床上用于病毒性肺炎，病毒性上呼吸道感染等病癥的治療。目前該藥品制劑熱原檢查主要采用家兔法[1]，但家兔法存在操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、靈敏度低等缺點(diǎn)，根據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法凝膠法，我們通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測(cè)內(nèi)毒素，對(duì)該制劑進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的探討和實(shí)驗(yàn)，并與家兔法進(jìn)行了比較，兩種方法結(jié)果一致。表明以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法取代家兔法檢測(cè)穿琥寧注射液的熱原是可行的。

1 儀器與材料

1.1 儀器

旋渦式混懸器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；電熱恒溫水箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠）；微量注射器（北京國(guó)營(yíng)青云儀器廠）；無熱原吸頭（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)131219）。

1.2 材料

鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，靈敏度0.5Eu/mL，批號(hào)：130713）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格0.5/支，批號(hào)：1306100，內(nèi)毒素含量≤0.015 EU·mL-1）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格180Eu/支，批號(hào)：2013-3）；穿琥寧注射液（規(guī)格：每支2 mL：40 mg；哈藥集團(tuán)三精制藥有限公司）3批；熱原實(shí)驗(yàn)用兔：經(jīng)吉林省科技廳審批的吉林省通化白山制藥廠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供，合格證號(hào)為006564。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑標(biāo)示靈敏度

（λ）的復(fù)核將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在快速混勻器上混和15 min，然后制成2.0、1.0、0.5、0.25λ等系列濃度，按中國(guó)藥典2010年版二部附錄XIE[2]方法操作。反應(yīng)終點(diǎn)濃度即是系列濃度遞減的內(nèi)毒素溶液中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度，標(biāo)示靈敏度為0.5EUmL-1的鱟試劑符合規(guī)定。

2.2 穿琥寧注射液細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定[3]

L=K/M，式中M為本品熱原檢查劑量1.0mlkg-1[1]，K為細(xì)菌內(nèi)毒素致熱閥5.0EUkg-1，本品細(xì)菌內(nèi)毒素理論限值，L=K/M=5/1.0=5.0 EUmL-1。

2.3 供試品的最大有效稀釋（MVD）

倍數(shù)選用鱟試劑靈敏度（λ）為0.5EUmL-1時(shí)，MVD=L/λ=5.0EUmL-1/0.5 EUmL-1=10（倍）

2.4 供試品干擾實(shí)驗(yàn)

根據(jù)穿琥寧注射液的最大有效稀釋倍數(shù)，我們用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將穿琥寧注射液稀釋成1∶5及1∶10濃度的稀釋液，分別做了干擾試驗(yàn)；將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成1.0、0.5、0.25、0.125EUmL-1的溶液，取上述溶液每一個(gè)濃度0.1 mL，分別加入λ=0.5EUmL-1的0.1 mL的鱟試劑中，在（37.0±1.0）℃水浴中保溫（60±2）min。結(jié)果，供試品1∶5濃度的稀釋液，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有抑制作用，而1∶10濃度的稀釋液，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無抑制作用也無增強(qiáng)作用；用檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品同上法稀釋，與鱟試劑反應(yīng)，每一濃度平行做4管，重復(fù)做3次。結(jié)果均相同。干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1結(jié)果顯示，供試品1∶10濃度的稀釋液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無抑制作用。

2.5 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果與家兔法檢測(cè)結(jié)果比較

取3批供試品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將穿琥寧注射液稀釋成1∶10濃度的稀釋液，用靈敏度為0.5EUmL-1的鱟試劑做細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，同時(shí)做陽性對(duì)照，陰性對(duì)照和供試品陽性對(duì)照，按中國(guó)藥典2010年版附錄XIE[2]操作，結(jié)果3批樣品均為陰性；家兔法熱原檢查按中國(guó)藥典2010年版二部附錄[4]進(jìn)行，家兔法檢測(cè)結(jié)果均為陰性；兩種檢測(cè)結(jié)果完全一致。

3 結(jié)論

穿琥寧注射液的熱原檢查[1]目前仍采用家兔法，費(fèi)時(shí)，成本高、操作繁瑣，影響因素較多。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，快速，重現(xiàn)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)論證，采用靈敏度為0.5EUmL-1的鱟試劑，以供試品1∶10濃度的稀釋液，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查而無干擾，并與家兔法檢查結(jié)果一致，因此，該法驗(yàn)證了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可用于穿琥寧注射液的內(nèi)毒素檢測(cè)。

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