SUMO-1基因沉默對(duì)人肺腺癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響

(1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052；2天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院)

摘要：目的觀察小泛素相關(guān)修飾因子1(SUMO-1)基因沉默后人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖及侵襲能力變化，探討SUMO-1在肺腺癌發(fā)病中的作用。方法培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞，分為RNA干擾(siRNA)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組。設(shè)計(jì)SUMO-1 siRNA片段，將SUMO-1 siRNA片段及陰性對(duì)照siNC片段分別轉(zhuǎn)染siRNA組及陰性對(duì)照組細(xì)胞，空白對(duì)照組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染 72 h 后，收集各組細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測(cè)SUMO-1 mRNA表達(dá)；采用蛋白印跡法檢測(cè)SUMO-1蛋白表達(dá)；采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24、48、72 h的細(xì)胞增殖情況，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率；采用Transwell小室測(cè)算轉(zhuǎn)染后侵襲細(xì)胞數(shù)。結(jié)果轉(zhuǎn)染后siRNA組SUMO-1 mRNA及蛋白表達(dá)均低于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P均<0.01)。siRNA組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率均高于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(P均<0.05)。siRNA組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組轉(zhuǎn)染后的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(36.0± 9.8)、(103.3± 14.0)、(117.3± 13.5)個(gè)，siRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)均少于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P均<0.01)。結(jié)論 沉默SUMO-1基因可抑制A549細(xì)胞的增殖及侵襲能力,SUMO-1具有促進(jìn)肺腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用。

關(guān)鍵詞：肺腺癌；RNA干擾；基因沉默；小泛素相關(guān)修飾蛋白類(lèi)；增殖；侵襲

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.010

中圖分類(lèi)號(hào)：R730.231；R734.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：(2015-08-01)

肺腺癌是起源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。小泛素相關(guān)修飾因子(SUMO)是一種泛素樣分子，主要參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程。SUMO-1基因是SUMO家族中的一員，在胃癌[1]、結(jié)腸癌[2]、乳腺癌[3]、口腔鱗癌[4]、淋巴瘤[5]等多種腫瘤中表達(dá)增高。研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中SUMO-1表達(dá)增高[6]。但目前對(duì)于SUMO-1在肺腺癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的研究較少。2014年9月～2015年2月，我們采用RNA干擾(siRNA)技術(shù)轉(zhuǎn)染人肺腺癌 A549細(xì)胞，觀察SUMO-1基因沉默后A549細(xì)胞的增殖及侵襲能力變化，探討SUMO-1在肺腺癌發(fā)病中的作用。

1材料與方法

1.1材料人肺腺癌 A549細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI 1640培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自Life Technologies公司；陽(yáng)離子脂質(zhì)體 Lipofectamine2000、噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma公司；兔抗人SUMO-1多克隆抗體購(gòu)自Proteinch公司；GAPDH一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或抗鼠IgG(二抗)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；細(xì)胞RIPA裂解液、PMSF、BCA試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)液購(gòu)自北京索萊寶公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó) Millipore公司。

1.2siRNA引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù) siRNA設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)各引物序列。SUMO-1 siRNA片段：上游5′-GGUGAAUAUAUUAAACUCATT-3′，下游5′-UGAGU-UUAAUAUAUUCACCTT-3′；陰性對(duì)照siNC片段：上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；下游5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，由吉?jiǎng)P基因公司合成。SUMO-1引物序列：上游5′-GAACATAT-GTCTGACCAGGAGGCAAAACC-3′，下游5′-GAACT-CGAGAACTGTTGAATGACCCCCCG-3′。GAPDH：上游5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′，下游5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′，由上海生工公司合成。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組將A549細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清+1%雙抗(青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL)+RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。0.25%胰酶消化，2～3 d傳代1次。分為siRNA組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組。

1.4SUMO-1 siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞將A549細(xì)胞按1×104/孔的密度接種于6孔板。將SUMO-1 siRNA片段及陰性對(duì)照siNC片段分別與脂質(zhì)體Lipofectamine2000結(jié)合后，分別轉(zhuǎn)染siRNA組及陰性對(duì)照組細(xì)胞?？瞻讓?duì)照組不轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染 72 h 后，收集各組細(xì)胞。

1.5轉(zhuǎn)染后SUMO-1 mRNA表達(dá)檢測(cè)采用RT-PCR法。收集各組細(xì)胞，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min、58 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s共30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。取 5 μL 的PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，以目的基因條帶與GAPDH條帶灰度比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

如前所屬，本次改造工程只有廠區(qū)西側(cè)的細(xì)長(zhǎng)地塊和東側(cè)廠前區(qū)少量預(yù)留用地可作為深度處理設(shè)施用地，綜合比較，我們選擇占地面積最小、工藝流程最簡(jiǎn)單、運(yùn)行費(fèi)用較低、運(yùn)行管理簡(jiǎn)單的濾布濾池方案作為本工程過(guò)濾方案。

1.6轉(zhuǎn)染后SUMO-1蛋白表達(dá)檢測(cè)采用蛋白印跡法。收集各組細(xì)胞，冰上裂解1 h，離心后收集上清，BCA 法行蛋白定量。取20 μg蛋白于10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠行電泳分離，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST漂洗，加入1∶5 000二抗。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑和膠曝光機(jī)曝光，以目的蛋白帶與GAPDH條帶灰度比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算采用MTT法。轉(zhuǎn)染后，取1×103/孔對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，用0.25%胰酶-EDTA消化，接種于96孔培養(yǎng)板，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每孔加入5 g/L的MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，每孔加入DMSO液150 μL，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔A570值，繪制連續(xù)3 d的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8轉(zhuǎn)染后侵襲細(xì)胞數(shù)測(cè)算采用Transwell小室法。調(diào)整各組細(xì)胞密度為1×104/mL，取細(xì)胞懸液100 μL，加入Matrigel膜被覆的Transwell小室上室內(nèi)，下室加600 μL完全培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2孵育24 h，使用0.2%的triton-100穿透30 min，吉姆薩染色，普通光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野中穿透基膜的細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)作為侵襲細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1各組轉(zhuǎn)染后SUMO-1 mRNA及蛋白表達(dá)比較siRNA組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組SUMO-1 mRNA表達(dá)量分別為0.226±0.078、0.861±0.049、0.869±0.054，蛋白表達(dá)量分別為0.176±0.078、0.524±0.036、0.553±0.067，siRNA組SUMO-1 mRNA及蛋白表達(dá)均低于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P均<0.01)。

2.2各組細(xì)胞增殖抑制率比較轉(zhuǎn)染后siRNA組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率均高于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(P均<0.05)，并且siRNA組轉(zhuǎn)染72 h時(shí)高于48 h時(shí)、48 h時(shí)高于24 h時(shí)(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　 各組不同時(shí)間點(diǎn)A549細(xì)胞增殖抑制率

注：與siRNA組比較，*P<0.05；與同組前一時(shí)間點(diǎn)比較，﹟P<0.05。

2.3侵襲細(xì)胞數(shù)比較siRNA組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組轉(zhuǎn)染后的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(36.0± 9.8)、(103.3± 14.0)、(117.3± 13.5)個(gè)/10 HP，siRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)均少于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組(P均<0.01)。

3討論

肺癌發(fā)病率居腫瘤的第2位，病死率居首位[7]。非小細(xì)胞肺癌中，肺腺癌的發(fā)病率逐年升高[8]。肺腺癌是一種異質(zhì)性較高的惡性腫瘤，患者的預(yù)后差異十分明顯[9]。腫瘤的形成和發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段的過(guò)程，包括多種癌基因、抑癌基因、抗凋亡基因、逆轉(zhuǎn)錄酶等的激活和凋亡。

SUMO-1蛋白是 SUMO蛋白家族之一，可與底物蛋白相結(jié)合，參與調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)錄、修復(fù)DNA、染色體分離等，發(fā)揮底物蛋白的亞細(xì)胞定位、底物蛋白的代謝與轉(zhuǎn)錄等生理功能，介導(dǎo)靶分子定位和功能調(diào)節(jié)[10～12]。SUMO-1可能通過(guò)參與蛋白—蛋白之間的相互作用，發(fā)揮DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，SUMO-1參與多種基因功能的調(diào)節(jié)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。SUMO-1修飾可通過(guò)調(diào)節(jié)p53、增殖細(xì)胞核抗原、雄激素受體等發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的功能[14]。在多種腫瘤組織中 SUMO-1呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)，抑制SUMO-1表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但目前在肺腺癌細(xì)胞中的研究尚少。本研究發(fā)現(xiàn)，采用siRNA技術(shù)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，siRNA組SUMO-1 mRNA及蛋白表達(dá)均低于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組，提示siRNA技術(shù)成功使A549細(xì)胞SUMO-1基因沉默；SUMO-1 siRNA轉(zhuǎn)染后，siRNA組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率均高于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組，siRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)少于陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組，提示沉默SUMO-1表達(dá)后A549細(xì)胞增殖抑制率增高、增殖速度下降、侵襲能力下降，抑制SUMO-1的表達(dá)可降低A549細(xì)胞的增殖及侵襲能力，證實(shí)SUMO-1具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] Mei D, Song H, Wang K, et al. Up-regulation of SUMO1 pseudogene 3 (SUMO1P3) in gastric cancer and its clinical association[J]. Med Oncol, 2013,30(4):709.

[2] Zhang H, Kuai X, Ji Z, et al. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer[J]. Cell Biochem Biophys, 2013,67(3):1081-1087.

[3] Dunnebier T, Bermejo JL, Haas S, et al. Common variants in the UBC9 gene encoding the SUMO-conjugating enzyme are associated with breast tumor grade[J]. Int J Cancer, 2009,125(3):596-602.

[4] Katayama A, Ogino T, Bandoh N, et al. Overexpression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated Mdm2 in oral squamous cell carcinoma: possible involvement in tumor proliferation and prognosis[J]. Int J Oncol, 2007,31(3):517-524.

[5] Zhang J, Huang FF, Wu DS, et al. SUMOylation of insulin-like growth factor 1 receptor, promotes proliferation in acute myeloid leukemia[J]. Cancer Lett, 2015,357(1):297-306.

[6] Han JY, Lee GK, Yoo SY, et al. Association of SUMO1 and UBC9 genotypes with tumor response in non-small-cell lung cancer treated with irinotecan-based chemotherapy[J]. Pharmacogenomics J, 2010,10(2):86-93.

[7] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(1):5-29.

[8] Toyoda Y, Nakayama T, Ioka A, et al. Trends in lung cancer incidence by histological type in Osaka, Japan[J]. Jpn J Clin Oncol, 2008,38(8):534-539.

[9] 毛友生,高燕寧,赫捷,等.肺癌分子生物學(xué)特性與轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系[J].中華腫瘤雜志,2006,28(8):632-634.

[10] Yuan YF, Zhai R, Liu XM, et al. SUMO-1plays crucial roles for spindle organization, chromosome congression, and chromosome segregation during mouse oocyte meiotic maturation[J]. Mol Reprod Dev, 2014,81(8):712-724.

[11] Marchiani S, Tamburrino L, Ricci B, et al. SUMO1 in human sperm: new targets, role in motility and morphology and relationship with DNA damage[J]. Reproduction, 2014,148(5):453-467.

[12] Jackson SP, Durocher D. Regulation of DNA damage responses by ubiquitin and SUMO[J]. Mol Cell, 2013,49(5):795-807.

[13] 袁浩,朱軍.蛋白質(zhì)的類(lèi)泛素化修飾[J].生命科學(xué),2010(11):1161-1166.

[14] Watson IR, Irwin MS. Ubiquitin and ubiquitin-like modifications of the p53 family[J]. Neoplasia, 2006,8(8):655-666.