新疆維族、漢族COPD易感性與ADAM33基因F+1、V4位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)系

王珊1，關(guān)鍵1，安瑞芬2，王莎莎1，許西琳1

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,新疆石河子832008；2伊犁哈薩克自治州新華醫(yī)院)

摘要：目的探討新疆維族、漢族慢性阻塞性肺疾病(COPD)易感性與解整合素-金屬蛋白酶33(ADAM33)基因F+1、V4位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)系。方法收集200例維族吸煙COPD患者(維族病例組)和211例維族吸煙健康者(維族對照組)；199例漢族吸煙COPD患者(漢族病例組)和210例漢族吸煙健康者(漢族對照組)外周血標(biāo)本，使用酚氯仿法提取DNA，運(yùn)用美國生物應(yīng)用系統(tǒng)公司(ABI)SNaPshot SNP分型技術(shù)檢測ADAM33基因F+1、V4位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性。采用方差分析分析兩民族病例組ADAM33基因F+1、V4位點(diǎn)基因型與肺功能相關(guān)臨床指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果維族、漢族病例組和對照組F+1位點(diǎn)CC、CT、TT 3種基因型分布和C、T等位基因分布頻率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；V4位點(diǎn)GG、CG、CC 3種基因型分布和C、G等位基因分布頻率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。維族病例組F+1、V4位點(diǎn)各基因型間第一秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值的百分比(FEV1% pred)、第一秒用力呼氣容積占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；漢族病例組V4位點(diǎn)GG基因型較其他基因型FEV1% pred、FEV1/FVC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；F+1位點(diǎn)3種基因型間肺功能比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論新疆維族、漢族COPD易感性與ADAM33基因F+1、V4位點(diǎn)多態(tài)性無關(guān)，漢族COPD患者V4位點(diǎn)GG基因型較其他基因型有更低的FEV1% pred、FEV1/FVC。

關(guān)鍵詞：慢性阻塞性肺疾??；解整合素-金屬蛋白酶33；多態(tài)性；單核苷酸；維吾爾族；漢族；新疆維吾爾自治區(qū)

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.006

中圖分類號：R563 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360009)。

作者簡介：第一王珊(1990-)，女，在讀碩士，主要研究方向?yàn)楹粑到y(tǒng)疾病。E-mail: 1245281784@qq.com

作者簡介：通信關(guān)鍵(1968-)，男，主任醫(yī)師，博士，主要研究方向?yàn)槁宰枞苑渭膊　-mail: Guanjian6@163.com

收稿日期：(2015-08-10)

Association between polymorphisms of F+1 and V4 locus in ADAM33 gene and susceptibility

to COPD in Xinjiang Uygur and Han population

WANGShan1, GUAN Jian, AN Rui-fen, WANG Sha-sha, XU Xi-lin

(1TheFirstAffiliatedHospitalofMedicalSchool,ShiheziUniversity,Shihezi832008,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the association between polymorphisms of F+1 and V4 locus in a disintegrin and metalloprotease domain 33 (ADAM33) gene and susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in Xinjiang Uygur and Han population. MethodsThe peripheral blood samples from 200 cases of COPD patients and 211 cases of healthy controls in smoking Uygur population and 199 cases of COPD patients and 210 cases of healthy controls in smoking Han population were collected. DNA was extracted. The single nucleotide polymorphism of F+1 and V4 (ADAM 33 gene) was detected by ABI SNaPshot SNP genotyping. Variance analysis was used to analyze the association between F+1,V4 genotypes in ADAM33 gene and clinical indicators of lung function in patients between Uygur and Han population. ResultsThere were no significant differences in the frequencies of F+1 locus CC, CT, TT genotypes and C, T alleles between the patient group and control group in Xinjiang Uygur and Han population (all P>0.05). There were no significant differences in the frequencies of V4 locus GG,CG,CC genotypes and G, C alleles between the patient group and control group in Xinjiang Uygur and Han population (all P>0.05). In the Uygur patient group, there were no significant differences in the percentage of forced expiratory volume in one second (FEV1)/the predicted value (FEV1% pred) and the percentage of forced expiratory volume in one second/forced vital capacity (FEV1/FVC) between different genotypes of F+1,V4 locus (all P>0.05). In the Han patient group, there were significant differences in the percentage of FEV1% pred and FEV1/FVC of V4 locus GG genotype (P<0.05). There were no significant differences in three genotypes of F+1 locus and clinical indicators of lung function (all P>0.05). ConclusionsThere is no significant correlation between the polymorphisms of F+1, V4 locus of ADAM 33 gene and the susceptibility to COPD in Xinjiang Uygur and Han population. COPD patients with V4 GG genotype have much lower FEV1% pred and FEV1/FVC than that of the other genotypes in Han population.

Key words: chronic obstructive pulmonary disease； a disintegrin and metalloprotease domain 33； polymorphism； single nucleotide； Uygur nationality； Han nationality; Xinjiang Uygur autonomus region

慢性阻塞性肺疾病(COPD)與氣道及肺組織對有害氣體或顆粒(煙草煙霧等)的慢性炎癥反應(yīng)異常增高相關(guān)[1]。吸煙是影響COPD發(fā)展的重要風(fēng)險(xiǎn)環(huán)境因素，近90%的COPD患者由長時(shí)間吸煙引起，但僅有25%的長期重度吸煙者發(fā)展為有癥狀的COPD[2]。個(gè)別地區(qū)或民族COPD 較高或較低的發(fā)病率，均不能證明該地區(qū)或民族生活方式中的危險(xiǎn)因素或吸煙程度要高于或低于另一地區(qū)或另一民族，這提示兩者間存在某些基因的差異決定了COPD 發(fā)病率的差別。目前已有大量研究表明，基因多態(tài)性與COPD易感性有關(guān)。國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為解整合素-金屬蛋白酶33(ADAM33)基因活性改變是氣道高反應(yīng)性及氣道重塑中成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞發(fā)生功能異常的基礎(chǔ)，與哮喘、氣道高反應(yīng)性(AHR)及肺功能下降相關(guān)，而氣道重塑和氣道炎癥及肺功能下降與COPD密切相關(guān)。目前大量研究證實(shí)ADAM33與COPD易感性存在相關(guān)性。2014年1月～2015年6月，我們探討ADAM33基因F+1、V4(rs511898、rs2787094)位點(diǎn)多態(tài)性( SNPs)與新疆維吾爾族、漢族人群吸煙COPD易感性相關(guān)性，并分析不同基因型對吸煙COPD患者肺功能的影響。

1資料與方法

1.1臨床資料吸煙COPD患者399例,入選標(biāo)準(zhǔn)參考我國中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》。COPD肺功能標(biāo)準(zhǔn)：第一秒用力呼氣容積占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)<70%。本研究納入維族吸煙COPD患者200例(維族病例組)，男112例、女88例，年齡(61.22±12.74)歲，吸煙指數(shù)(470.93±25.86)支/年，BMI(25.16±4.15)kg/m2,FEV1占預(yù)計(jì)值的百分比(FEV1% pred)為(51.83±13.12)%,FEV1/FVC(54.73±10.78)%。漢族吸煙COPD患者199例(漢族病例組)，男159例、女40例，年齡(61.59±13.49)歲，吸煙指數(shù)(512.14±27.08)支/年，BMI(23.78±3.60)kg/m2,FEV1% pred為(60.32±12.91)%,FEV1/FVC為(61.96±7.84)%。同期選取211例維族、210例漢族吸煙健康體檢者分別納入維族對照組和漢族對照組，維族對照組中男134例、女77例，年齡(59.29±10.36)歲，吸煙指數(shù)(444.24±23.88)支/年，BMI為(24.83±2.87)kg/m2,FEV1% pred為(81.72±10.77)%,FEV1/FVC為(82.93±7.75)%。漢族對照組中男169例、女41例，年齡(59.79±10.18)歲，吸煙指數(shù)(468.48±27.47)支/年，BMI為(23.95±3.32)kg/m2,FEV1% pred為(78.08±13.09)%,FEV1/FVC為(80.49±8.26)%。病例組、對照組均排除胸廓畸形、胸部手術(shù)史，所有人員經(jīng)詳細(xì)病史詢問、體格檢查、胸部X線片和肺功能測定等檢查除外肺癌、肺栓塞、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核、間質(zhì)性肺疾病、支氣管哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病，并排除有近期手術(shù)史、感染性疾病、明顯心功能不全、自身免疫性疾病、嚴(yán)重的內(nèi)分泌、腎臟或肝臟病史患者。本研究經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，入選對象均簽署知情同意書。兩民族對照組、病例組間性別、年齡、吸煙指數(shù)、BMI比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而FEV1% pred、FEV1/FVC比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1.2ADAM33基因F+1、V4位點(diǎn)多態(tài)性檢測采集入選對象外周靜脈血5 mL，加入EDTA抗凝管中，使用酚氯仿法提取DNA，置于-80 ℃保存檢測。根據(jù)GenBank提供的基因序列，在線Primer3軟件設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用SNaPshot進(jìn)行分型；對分型結(jié)果進(jìn)行雙盲樣本質(zhì)控和陰性對照質(zhì)控，HWE質(zhì)檢及MAF合理性的質(zhì)檢。SNaPshot反應(yīng)過程中SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)延伸引物序列:F+1:TTTTTCTATAGCCCTCCAAATCAGAAGAGAC；V4：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGACTGAGTC-CACACTCCCCTG。PCR擴(kuò)增反應(yīng)：1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物。多重PCR反應(yīng)采用Touch-down PCR反應(yīng)程序，PCR擴(kuò)增后，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物1.5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，有目的片段則提示擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)成功。PCR產(chǎn)物純化：在10 μL PCR產(chǎn)物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，37 ℃溫浴1 h, 然后75 ℃滅活15 min。SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)：在10 μL 延伸產(chǎn)物中加1 U SAP酶，保溫(37 ℃)1 h，后滅活(75 ℃)15 min。延伸產(chǎn)物測序：取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5 μL Liz120 SIZE STAN-DARD，9 μL Hi-Di Formamide混勻，總體積10 μL，95 ℃變性5 min后上ABI3730XL測序儀。運(yùn)用GeneMapper4.1軟件分析ABI3730XL測序儀上收集的原始數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。采用χ2檢驗(yàn)分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。采用χ2檢驗(yàn)分析同民族病例組與對照組的F+1、V4位點(diǎn)基因型和等位基因頻率是否存在差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1ADAM33基因F+1、V4位點(diǎn)電泳產(chǎn)物結(jié)果F+1位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一長278 bp的DNA 片段；V4位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一長313 bp的DNA 片段。

2.2兩民族對照組與病例組基因型及等位基因頻率分布比較維族、漢族F+1、V4位點(diǎn)(rs511898、rs2787094)的基因型頻率均符合Handy-Weinberg遺傳平衡定律，證明所收集的兩民族研究樣本的群體代表性良好。同民族病例組與對照組中F+1、V4位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布比較均無明顯差異(P>0.05)，見表1、2。

2.3兩民族病例組ADAM33基因F+1、V4位點(diǎn)基因型與肺功能的關(guān)系維族病例組：F+1及V4位點(diǎn)各基因型間FEV1% pred、FEV1/FVC比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。漢族病例組：V4位點(diǎn)3種基因型間FEV1% pred、FEV1/FVC比較有顯著差異(P<0.05)；F+1位點(diǎn)3種基因型間肺功能比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3、4。

表1　維族對照組與維族病例組F+1、V4位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布比較[例]

表2　漢族對照組與漢族病例組F+1、V4位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布比較[例]

表3　維族病例組ADAM33基因F+1、V4位點(diǎn)基因型與肺功能的關(guān)系

表4　漢族病例組ADAM33基因F+1、V4位點(diǎn)基因型與肺功能的關(guān)系

3討論

ADAM33基因位于第20號染色體的短臂13號位(20p13)，編碼一種基質(zhì)金屬蛋白酶，包含813個(gè)氨基酸，在間充質(zhì)細(xì)胞中選擇性表達(dá)。ADAM33基因除鋅結(jié)合位點(diǎn)，還有鈣結(jié)合位點(diǎn)，具有高度判別底物特異性的功能[3～5]。2002年Van Eerdewegh等[6]研究首次顯示ADAM33基因的SNPs及其單倍型與哮喘發(fā)生和AHR呈顯著相關(guān),確定ADAM33基因是哮喘易感基因。2005年van Diemen等[7]提出ADAM33基因單核苷酸多態(tài)性與肺功能下降相關(guān)，而氣道重塑和氣道炎癥及肺功能下降及COPD密切相關(guān)，由此推測ADAM33基因SNPs同樣參與了COPD的發(fā)病機(jī)制及病程進(jìn)展。Gosman等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ADAM33基因4個(gè)位點(diǎn)(S2、T1、T2、ST + 5)與COPD的發(fā)病相關(guān)。Sadeghnejad 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ADAM33基因的5個(gè)位點(diǎn)(Q-1, S1, S2, V1 和V4)與長期吸煙患者COPD及肺功能下降相關(guān)。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn),ADAM33基因4個(gè)位點(diǎn)(V4, T2, T1 和 S1)與COPD易感性明顯相關(guān)。張偉兵等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ADAM33與吸煙COPD人群發(fā)病相關(guān)，并影響COPD患者肺功能。蔣濤等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ADAM33基因2個(gè)位點(diǎn)(V4、S1)與新疆哈薩克族人群COPD易感性明顯相關(guān)。遲令福等[13]研究發(fā)現(xiàn)，ADAM33基因F+1位點(diǎn)與山西地區(qū)漢族COPD患者發(fā)病相關(guān)。Tan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ADAM33基因S1、S2、Q-1和F+1位點(diǎn)與COPD的易感性有一定關(guān)聯(lián)。覃潔等[15]研究發(fā)現(xiàn),ADAM33基因的S2、F+1、V4位點(diǎn)與內(nèi)蒙古鑲黃旗地區(qū)蒙古族COPD有相關(guān)性。Zhou等[16]研究發(fā)現(xiàn)，ADAM33基因T1、T2、S1、Q-1、F+1、ST+5位點(diǎn)與COPD的發(fā)生相關(guān)。上述研究結(jié)果表明目前國內(nèi)外對不同地域、不同人群F+1、V4位點(diǎn)與COPD的發(fā)生有無相關(guān)性仍未得出一致結(jié)論。

新疆是一個(gè)多民族人群聚居區(qū)，維吾爾族對于新疆各少數(shù)民族基因多態(tài)性和基因易感性的研究更具代表性。本研究采用病例對照研究方法，以中國新疆維吾爾族、漢族人群吸煙COPD患者和健康吸煙個(gè)體為研究對象，對ADAM33基因F+1、V4位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與新疆維吾爾族、漢族人群中COPD易感性相關(guān)性進(jìn)行研究，并分析不同基因型對吸煙COPD人群肺功能的影響。本研究未發(fā)現(xiàn)ADAM33基因F+1、V4位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與新疆維族、漢族人群吸煙COPD發(fā)病具有相關(guān)性。同時(shí)分析病例組ADAM33基因F+1、V4位點(diǎn)基因型肺功能指標(biāo)之間的關(guān)系，結(jié)果表明維族F+1、V4位點(diǎn)各基因型間FEV1% pred、FEV1/FVC比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；漢族V4位點(diǎn)3種基因型間FEV1% pred、FEV1/FVC比較有顯著差異, 而F+1位點(diǎn)3種基因型間肺功能比較均無明顯差異，提示漢族COPD患者V4位點(diǎn)GG基因型較其他基因型有更低的FEV1% pred、FEV1/FVC，說明ADAM33基因V4GG基因型對漢族COPD患者的肺功能有影響。當(dāng)ADAM33基因上發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或替換時(shí)，可能會導(dǎo)致氨基酸序列產(chǎn)生變化，影響蛋白質(zhì)功能，刺激氣道導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞的增殖分化，亦可通過外基質(zhì)與間充質(zhì)細(xì)胞黏附，增加間充質(zhì)細(xì)胞的遷移力、延展性，過多地表達(dá)膠原纖維及平滑肌纖維參與氣道重塑，本研究可證實(shí)ADAM33影響吸煙漢族COPD的肺功能。

本實(shí)驗(yàn)得出ADAM33基因F+1、V4位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與新疆維族、漢族人群吸煙COPD易感性可能無關(guān)，仍需在相同民族人群中擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更深入研究。

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