論著

miR129在胃腺癌中的表達(dá)及意義

牟時(shí)斌牟云高峰

作者單位： 054900河北省臨西縣人民醫(yī)院(牟時(shí)斌);河北省民政總醫(yī)院(牟云);河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院(高峰)

【摘要】目的探討microRNA129(miR129)在胃管狀腺瘤、胃癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法收集經(jīng)高年資病理醫(yī)師確診的55例管狀腺瘤、76例胃腺癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織，分別用原位雜交方法檢測(cè)miR129的表達(dá)，分析miR129表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果癌旁胃黏膜組織中miR-129的表達(dá)陽(yáng)性率高于胃管狀腺瘤組織，胃管狀腺瘤組織中miR-129的表達(dá)陽(yáng)性率高于胃腺癌組織(P<0.05)。miR129在高分化胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率高于中、低分化組織(P<0.05)；臨床分期Ⅰ期中的陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅲ期;無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)陽(yáng)性率高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織(P<0.05)；胃管狀腺癌中miR129陽(yáng)性率高于彌漫型腺癌(P<0.05)。結(jié)論miR129在胃腺癌組織內(nèi)低表達(dá)，發(fā)揮著抑癌基因的作用；miR129可作為胃腺癌的判斷預(yù)后的標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】病理學(xué)；腺癌；原位雜交；miR-129；抑癌基因

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.005

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 735.2

收稿日期：(2015-03-10)

Expression and clinical significance of miR129 in gastric adenocarcinomaMOUShibin*,MOUYun,GAOFeng.*People’sHospitalofLinxiCounty,Hebei,Linxi054900,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of microRNA129 (miR129) in gastric tubular adenoma tissues,gastric adenocarcinoma tissues and corresponding para-carcinoma tissues.MethodsFifty-five cases of gastric tubular adenoma, 76 cases of gastric adenocarcinoma and corresponding para-carcinoma tissues that were identified by senior pathology doctors were enrolled in the study. The expression levels of miR-129 were detected by in situ hybrization,and the correlation between miR129 expression and clinicopathological parameters was analyzed.ResultsThe positive expression rate of miR-129 in para-carcinoma gastric mucosa tissues was significantly higher than that in gastric tubular adenoma tissues,moreover, which in gastric tubular adenoma tissues was significantly higher than that in gastric adenocarcinoma tissues (P<0.05). The positive expression rate in well differentiated gastric cancer tissues was significantly higher than that in moderately differentiated and poorly differentiated tissues (P<0.05). The positive expression rate of miR-129 in stageⅠcarcinoma tissues was obviously higher than that in stage Ⅲ carcinoma tissues,furthermore, which in carcinoma tissues without lymphonode metastasis was significantly higher than that in carcinoma tissues with lymphonode metastasis (P<0.05). The positive expression rate of miR-129 in gastric tubular adenoma was significantly higher than that in diffuse type adenocarcinoma (P<0.05).ConclusionThe expression levels of miR129 are down-regulated in gastric adenocarcinoma,which may play a role of anti-oncogene,thus miR-129 may be regarded as a marker for evaluating the prognosis of patients with gastric adenocarcinoma.

【Key words】pathology;adenocarcinoma;hybridization in situ;miR-129;anti-oncogene

胃癌是人類(lèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在國(guó)內(nèi)較為常見(jiàn)，且病死率高。它位居惡性腫瘤死亡的首位,由于胃癌往往沒(méi)有特征性的癥狀及體征，許多胃癌患者確診時(shí)往往已經(jīng)處于中晚期[1]，貽誤了最佳治療時(shí)機(jī)，所以尋找胃癌的標(biāo)志物是非常必要的。MicroRNA是一類(lèi)約22個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，通過(guò)與mRNA的3’URT結(jié)合而使其降解或翻譯受阻[2]，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達(dá)，研究顯示miRNA在多種人類(lèi)腫瘤中表達(dá)紊亂[3]，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[4-6]。

1資料與方法

1.1一般資料收集2005至2013年在臨西縣人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的胃癌標(biāo)本76例，癌腫原發(fā)病灶最大直徑2.0～5.0 cm，并選取每個(gè)病例中對(duì)應(yīng)的癌旁正常胃黏膜(距離癌灶>5 cm)作為對(duì)照，另選取胃黏膜管狀腺瘤標(biāo)本55例，所選標(biāo)本均采用甲醛固定，石蠟包埋，按照WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三級(jí)，分期采用TNM分期系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。所選76例中男40例，女36例；平均年齡48歲?；颊咝詣e、年齡、分級(jí)、分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及Laurens分型是通過(guò)復(fù)習(xí)患者病理記錄底單而獲得。

1.2主要試劑miR129互補(bǔ)(其堿基序列為5’-AAGTGACTGAAACGTAGCCT-3’)探針，poly d(T)陽(yáng)性對(duì)照探針及miR129正義陰性對(duì)照探針均購(gòu)于北京金薩卜生物科技公司，胃蛋白酶K、雜交液及NBT/BCIP顯色液均購(gòu)于北京中杉金橋公司。

1.3原位雜交(1)貼附有胃癌及癌旁組織的石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度酒精水化。(2)用胃蛋白酶室溫消化90～120 s以暴露RNA的核酸片段。(3)切片滴加20 μl預(yù)雜交液40℃ 恒溫處理3 h。(4)每張切片滴加20 μl稀釋探針，蓋上蓋玻片42℃雜交過(guò)夜。(5)揭掉蓋玻片，室溫下，用SSC洗滌3次，滴加封閉液。(6)滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 處理1 h，洗滌。(7)滴加SABC 37℃ 處理20 min,0.5 mol/L PBS沖洗。(8)玻片滴加生物素化過(guò)氧化物酶37℃ 20 min,PBS沖洗。(9)用NBT/BCIP顯色試劑在玻片上染色。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)原位雜交切片以胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)，每張切片在顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野均計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，結(jié)合表達(dá)情況應(yīng)用改進(jìn)的雙評(píng)分半定量法評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0計(jì)為0分，1%～25%計(jì)為1分，26%～50%計(jì)為2分，51%～75%計(jì)為3分，76%～100%計(jì)為4分；細(xì)胞著色強(qiáng)度:細(xì)胞未著色計(jì)為0分，淡黃色計(jì)為1分，黃棕色計(jì)為2分，棕色計(jì)為3分。二種計(jì)分相乘，得分0～3分作為陰性(-)表達(dá)，4～12分計(jì)為陽(yáng)性(+)表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1癌旁胃黏膜、胃管狀腺瘤及原發(fā)性胃腺癌中miR-129的表達(dá)在癌旁胃黏膜、胃管狀腺瘤及原發(fā)性胃腺癌中miR129表達(dá)的陽(yáng)性率為94.7%、83.6%、75.0%，其陽(yáng)性程度隨著病變程度的加深而減低(P<0.05)，且不同組別之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1～5。

表1　miR129在不同胃組織中的表達(dá)　例(%)

圖1miR129在癌旁胃黏膜中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(DAB顯色,×200)

圖2miR129在胃腺瘤中呈較強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(DAB顯色,×200)

2.2胃腺癌中miR129的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系miR-129在WHO分化Ⅰ級(jí)比WHOⅡ級(jí)中的表達(dá)陽(yáng)性率高，在WHOⅡ級(jí)比WHOⅢ級(jí)中陽(yáng)性率高;miR-129在Ⅰ期中的陽(yáng)性率比Ⅱ期中高，在Ⅱ期比Ⅲ期高;miR-129在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性率比有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中高；miR129在胃腸型腺癌中的陽(yáng)性率高于彌漫型腺癌，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同性別、年齡組患者胃腺癌組織中miR-129的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

圖3miR129在高分化胃腺癌中呈陽(yáng)性表達(dá)(DAB顯色,×400)

圖4miR129在中分化腺癌中呈弱陽(yáng)性表達(dá)(DAB顯色,×400)

圖5miR129在低分化胃腺癌中極弱陽(yáng)性表達(dá)(DAB顯色,×400)

表2　臨床病理參數(shù)與miR129表達(dá)之間的關(guān)系　例(%)

3討論

最近十余年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA參與了包括癌癥在內(nèi)的人類(lèi)疾病的發(fā)病過(guò)程。據(jù)報(bào)道，在一些癌癥中存在著miR129的異常表達(dá)，并直接涉及了癌癥的發(fā)生、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等過(guò)程[7-9]。這些資料提示miR-129在多種癌癥中起著不同的作用，但是對(duì)胃癌患者中miR129的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后之間的關(guān)系還知之甚少。本研究側(cè)重于miR129的表達(dá)水平與胃癌各種臨床病理參數(shù)之間潛在的關(guān)系。由于miRNA在甲醛固定的標(biāo)本中能得到較好的保存，這就是使其在常規(guī)的組織研究中成為富有價(jià)值的研究對(duì)象[10]。以前的研究多采用RT-PCR方法揭示了miR-129與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后較差明顯相關(guān)[11]。這些關(guān)于miRNA臨床預(yù)后的研究都是通過(guò)提取癌組織蠟塊中RNA并采用qRT-PCR方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的。癌組織塊中既包含實(shí)質(zhì)性腫瘤細(xì)胞，又包含腫瘤相關(guān)間質(zhì)細(xì)胞，所以采用從整體癌組織中的RNA提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)很可能會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果。近來(lái)資料顯示在腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中也存在microRNA的高表達(dá)[12]。原位雜交的主要優(yōu)點(diǎn)是能在細(xì)胞水平上精確檢測(cè)陽(yáng)性信號(hào)。

經(jīng)過(guò)本次研究，我們發(fā)現(xiàn)miR129表達(dá)于良性胃黏膜上皮細(xì)胞的胞漿之中，在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)則明顯降低；并且miR129的表達(dá)隨著胃癌分級(jí)、分期的加重及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)而降低；miR-129在腸型腺癌中的表達(dá)高于彌漫型腺癌。有研究報(bào)道，miR-129在結(jié)腸癌[13，14]及肝癌[15]中表達(dá)降低，并且miR129的表達(dá)降低與結(jié)腸癌的臨床分期及演進(jìn)明顯正相關(guān)[13]，這與本研究的結(jié)果相一致。有人報(bào)道結(jié)腸癌中的miR129的表達(dá)降低是由于miR-129基因啟動(dòng)子的高甲基化引起的[15]。最近幾年的研究結(jié)果顯示在子宮內(nèi)膜癌中miR-129的作用的靶標(biāo)是SOX4基因，由于miR129啟動(dòng)子的甲基化導(dǎo)致miR-129的表達(dá)的降低，從而導(dǎo)致在癌變過(guò)程中SOX4的表達(dá)升高[16]，類(lèi)似的結(jié)果也見(jiàn)于食管癌及肝細(xì)胞肝癌[17，18]。在上述癌癥中SOX4基因的高表達(dá)在癌癥演進(jìn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著非常重要的作用[19]。除了SOX4，最近的研究表明在結(jié)腸癌中miR-129通過(guò)抑制Bcl-2的表達(dá)而發(fā)揮調(diào)節(jié)癌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵作用[20]，miR-129還通過(guò)抑制E2F3的表達(dá)而影響細(xì)胞周期。目前充足的證據(jù)表明miR-129的表達(dá)缺失與結(jié)腸癌，肝癌及胃癌等惡性腫瘤的演進(jìn)密切相關(guān)，所以miR-129能作為胃癌等惡性腫瘤的預(yù)后因子。

由于miRNA不但能在甲醛固定石蠟包埋的組織中而且能在細(xì)胞外穩(wěn)定存在，所以可以作為通過(guò)抽血而測(cè)定的具有可重復(fù)性的生物標(biāo)記物[21]，因此檢測(cè)miR-129可能作為胃癌的無(wú)創(chuàng)性的重要輔助診斷工具；通過(guò)檢測(cè)胃液中的miR-129的濃度還能判斷胃癌的預(yù)后[22]。

總之，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR129在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著抑癌基因的作用，miR-129的表達(dá)下調(diào)預(yù)示著胃癌預(yù)后較差。miR-129有望成為判斷胃癌預(yù)后的重要手段。

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