曹林峰，趙　卉，秦厚應，張　程，徐德祥

(1．安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院呼吸內科，安徽 合肥　230601；2．安徽醫(yī)科大學衛(wèi)生毒理學系，安徽 合肥　230032)

褪黑素減輕博來霉素誘發(fā)小鼠肺纖維化早期的內質網應激反應

曹林峰1，趙卉1，秦厚應1，張程2，徐德祥2

(1．安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院呼吸內科，安徽 合肥230601；2．安徽醫(yī)科大學衛(wèi)生毒理學系，安徽 合肥230032)

中國圖書分類號：R-332；R329.24；R563.13；R977.1

摘要：目的探討褪黑素(MT)是否能減輕由博來霉素(BLM)誘發(fā)小鼠肺纖維化早期的內質網應激反應。方法將成年健康♂ ICR小鼠隨機分為對照組、MT組、BLM組和MT+BLM組。MT組小鼠給予生理鹽水前30 min經腹腔注射MT(10 mg·kg-1)，并在給予生理鹽水后按每24 h一次經腹腔注射MT(10 mg·kg-1)，BLM組小鼠經氣管插管單次給予BLM(5 mg·kg-1)，MT+BLM組小鼠在給予BLM(5 mg·kg-1)前30min經腹腔注射給予MT(10 mg·kg-1)，并在給予BLM后按每24 h一次經腹腔注射給予MT(10 mg·kg-1)，對照組小鼠經氣管插管給予等容積的生理鹽水。各組分別在BLM處理后不同時間點(24、72 h)剖殺小鼠并取材，肺組織進行病理切片，HE染色法觀察肺部炎性細胞浸潤情況，Western blot檢測內質網(ER)應激相關蛋白(GRP78、p-eIF2α和p-IRE1α)的表達水平，免疫組化檢測ER應激相關蛋白(GRP78、p-IRE1α、ATF6α和p-PERK)的分布。結果成功構建了小鼠肺纖維化急性炎癥模型；在BLM處理后，肺重、肺重比和肺炎性細胞浸潤明顯增加，并呈明顯時間-效應關系；MT可明顯降低BLM引起的肺重和肺重比增加，減輕肺部炎性細胞浸潤；Western blot顯示，MT處理后明顯對抗BLM引起的ER應激敏感蛋白GRP78蛋白的上調，抑制BLM引起的UPR通路相關蛋白eIF2α和IRE1α磷酸化；免疫組化結果顯示，MT可降低BLM誘導的ER應激相關蛋白GRP78、p-IRE1α、ATF6α和p-PERK的表達。結論MT可減輕BLM誘發(fā)的小鼠肺纖維化早期ER應激反應。

關鍵詞:褪黑素；博來霉素；炎癥；肺纖維化；內質網應激；GRP78蛋白

特發(fā)性肺纖維化是一種致命性的肺部疾病，其進展緩慢、預后差。診斷后平均生存期為3年，目前臨床上藥物治療效果不佳，其發(fā)病機制仍不明確[1]。目前，對于肺纖維化的研究主要集中于采用博來霉素(bleomycin，BLM)誘導的小鼠肺纖維化模型[2]，通過對該模型的研究發(fā)現其發(fā)病機制可能與氧化應激[3]、炎癥反應、上皮間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)[4-5]等有關。最近的研究證實，內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)也參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程[6,7]。

褪黑素(melatonin，MT)是脊椎動物松果體產生和釋放的一種神經激素，MT通過抗氧化及抗炎作用對BLM誘導的小鼠慢性肺纖維化起保護作用[8]。最近的研究表明，MT對BLM誘導的小鼠慢性肺纖維化的保護可能通過抑制ER stress反應起作用[9]。另一方面，肺纖維化的形成需經歷炎癥期、纖維化形成期、纖維化進展期等階段[10]，其中，早期炎癥對慢性纖維化的形成起關鍵作用。而ER 是維持細胞生存和正常功能所必需的一種重要細胞器，在受到外界化學等刺激后可以通過ER stress引起炎癥反應[7]，但在BLM誘發(fā)小鼠肺纖維化早期，MT是否影響ER stress反應尚不清楚。本研究在BLM誘導小鼠肺纖維化早期炎癥的基礎上，進一步探討了MT對BLM誘導小鼠肺纖維化早期的保護作用是否影響ER stress反應。

1材料與方法

1.1主要試劑 MT購于美國Sigma化學試劑公司(批號：SLBC7539V)；BLM購于日本化藥株式會社(批號：430312)；GRP78(批號：3177S)、p-PERK(批號：3719S)、p-eIF2α(批號：9721S)抗體購自美國Cell Signal公司；ATF6α(批號：A2811)抗體購自美國Santa Cruz公司；β-actin(批號：BM0627)抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；p-IRE1α(批號：16927)和ECL發(fā)光液購自美國Thermo Scientifis公司(批號：LB141873)；SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物公司(批號：13152)； DAB購自Sigma公司；無水乙醇(純度>99.7%)購于上海振企化學試劑有限公司；其他試劑均購自Sigma公司。

1.2實驗動物♂ ICR小鼠,6~8周齡，(30±2) g，清潔級,購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。實驗前適應性喂養(yǎng)1周(自由進食標準飼料、水，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節(jié)律，溫度20℃~25℃，相對濕度(50±5)%。

1.3動物分組和處理36只♂ ICR成年健康小鼠隨機分為對照組(Control組)、MT組各6只，BLM組和MT+BLM組各12只。BLM組小鼠采用腹腔給予10%水合氯醛麻醉(3 ml·kg-1)，約10 min后小鼠完全麻醉，予以微量注射器行氣管插管滴注單次給予BLM(5 mg·kg-1)，立即將小鼠直立沿順時針及逆時針各旋轉1 min，使藥物均勻分布；Control組小鼠經氣管插管給予等容積的生理鹽水；MT+BLM組小鼠在給予BLM(5 mg·kg-1)前30 min和給予BLM后按每24 h一次經腹腔注射給予MT(10 mg·kg-1)，MT組小鼠在給予生理鹽水前30 min和給予生理鹽水后按每24 h一次經腹腔注射MT(10 mg·kg-1)。分別在BLM處理后不同時間點(24、72 h)剖殺小鼠并取材，稱量肺臟重量，取部分肺臟組織放入4%多聚甲醛溶液固定，其余肺臟組織放入-80 ℃冰箱中保存。

1.4HE染色肺臟組織經4%多聚甲醛溶液固定后，石蠟包埋，切片，常規(guī)石蠟切片，酒精梯度脫蠟至水化，蘇木精染色3 min，流水沖洗10 min，伊紅染色2 min，流水沖去浮色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。同時，每張病理切片分別進行病理評分，定義0為正常肺組織，1、2、3、4和5分別表示炎性細胞浸潤的范圍百分比分別為10%、10%~30%、30%~80%和80%以上。

1.5Western blot取一定量的肺臟組織，加入組織裂解液制備成20%的組織勻漿液，離心、取上清、定量、蛋白變性?？偟鞍讟悠方汼DS-PAGE電泳后轉移到PVDF膜，5%脫脂牛奶溶液封閉后，分別用GRP78、p-eIF2α或p-IRE1α等一抗室溫孵育3 h，DPBST浸洗液浸洗3次(每次10 min)，用DPBS洗一次(10 min)，用對應的IgG二抗(羊抗鼠或羊抗兔)孵育2 h，DPBST浸洗液浸洗3次(每次10 min)，用DPBS洗一次(10 min)，再用ECL發(fā)光液孵育5 min，于自動成像儀曝光攝片。運用Carestream Molecular Imaging (MI) Software圖像分析軟件測定各蛋白條帶的灰度值。

1.6免疫組織化學染色肺臟組織的常規(guī)石蠟切片經酒精梯度脫蠟至水化，于切片上滴加0.3%過氧化氫，室溫下10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，檸檬酸鈉緩沖液微波中高火修復抗原2次，每次5 min，用5%的羊血清來封閉非特異性蛋白，37℃恒溫30 min；分別用GRP78、p-IRE1α、ATF6α或p-PERK一抗孵育，37℃恒溫30 min，再置4℃冰箱過夜；相應二抗孵育，37℃恒溫30 min；再進行SP反應，DAB顯色，經復染、脫水、透明、封片。在光學顯微鏡(×100)觀察各內質網應激蛋白分布情況。

2結果

2.1MT對BLM所致小鼠肺纖維化早期肺損傷的生理指標影響 與Control組相比，小鼠給予BLM處理后24 h與72 h的肺重和肺重比明顯增加(Tab 1，P<0.05)，而72 h較24 h肺重增加更為明顯。與單純BLM處理后24 h相比，MT+BLM處理后24 h的肺重及肺重比有所減低，差異沒有統(tǒng)計學意義。與BLM處理后72 h相比，MT+BLM處理后72 h肺重及肺重比有所降低(Tab 1，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。

2.2MT對BLM所致小鼠肺纖維化早期肺損傷的病理影響肺組織HE染色顯示，給予BLM處理24 h與72 h后，肺泡內出現明顯炎性細胞浸潤，但肺間質及肺泡壁未見明顯破壞(Fig 1A)。與Control組相比，BLM處理72 h和24 h后，HE染色肺病理評分有明顯提高(P<0.05)，并且72 h炎性細胞浸潤及病理評分都較24 h更為明顯(Fig 1B)。如Fig 1A所示，與單純BLM處理后24 h相比，MT+BLM處理后24 h的小鼠肺炎性細胞浸潤有所減輕，并且MT+BLM處理后72 h比BLM處理后72 h減輕明顯。如Fig 1B所示，與BLM處理后72 h相比，MT+BLM處理后72 h的HE染色病理評分明顯降低(P<0.05)。

GroupControlMTBLM24h72hMT+BLM24h72hLungweight/g0.189±0.0070.186±0.0110.214±0.011*0.230±0.007*0.205±0.0100.209±0.014#Lungweightratio/%0.598±0.0130.598±0.0200.704±0.027*0.755±0.038*0.654±0.9400.662±0.045#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsBLM 72 h.

±s, n=6)

1:Control; 2:MT; 3:BLM 24 h; 4: MT+BLM 24 h; 5:BLM 72 h; 6:MT+BLM 72 h

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsBLM in each group.

2.3Western blot檢測MT對BLM所致小鼠肺纖維化早期的ER stress相關蛋白的影響給予BLM 72 h后小鼠肺組織中GRP78的表達較Control組明顯升高(Fig 2A，P<0.05)，并且eIF2α和IRE1α磷酸化水平在BLM處理72 h后較Control組明顯增加。而與單純BLM處理后72 h比較，MT+BLM處理后72 h小鼠肺組織中GRP78的表達明顯降低(Fig 2，P<0.05)。同樣，與BLM處理后72 h相比，MT+BLM處理后72 h小鼠肺組織中IRE1α和eIF2α的磷酸化水平明顯降低(Fig 2，P<0.05)。

2.4免疫組化檢測MT對BLM所致小鼠肺纖維化早期的ER stress相關蛋白的影響如Fig 3所示，與Control組比較，BLM處理后小鼠肺組織GRP78、p-IRE1α、ATF6α和p-PERK的免疫組化結果中DAB顯色陽性的細胞明顯增加。與單純BLM處理后72 h比較，MT+BLM處理后72 h小鼠肺組織GRP78、p-IRE1α、ATF6α和p-PERK的免疫組化結果中DAB顯色陽性的細胞明顯減少。

3討論

BLM誘發(fā)的小鼠肺纖維化模型經歷炎性期、纖維化形成期、纖維化進展期。本研究以炎性期為研究基礎，發(fā)現在肺纖維化炎癥期，小鼠肺重及肺重比明顯升高，同時肺組織HE染色可見炎性細胞浸潤，而肺間質及肺泡壁未見明顯破壞，同時病理評分結果與HE染色結果一致，炎性損傷呈時間-效應關系。另一方面，我們的研究結果顯示，與BLM組的小鼠相比，給予MT干預的小鼠肺組織中炎性細胞的浸潤明顯減少，且病理評分也明顯降低，這與Kim等[11]報道的MT對肺纖維化保護機制與抗炎作用有關相一致。這些結果都表明炎癥在BLM誘發(fā)的小鼠肺纖維化的形成過程中起著重要的作用。

A: GRP78 in the lungs was detected by immunoblots; B: p-eIF2α in the lungs was detected using immunoblots; C: p-IRE1α in the lungs was detected by immunoblots.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsBLM 72 h group.

Fig 3　Effects of melatonin on BLM-induced ER stress determined by immunohistochemistry at 72 h (×100)

最近的研究表明，ER stress 反應在炎癥發(fā)生過程中起重要作用[7,12]。內質網(endoplasmic reticulum，ER)是真核生物的一個細胞器，它在蛋白質的折疊、脂類合成、糖原的合成和儲存以及鈣的代謝等方面起決定性的作用[13]。各種生理和病理刺激，如化學損傷、DNA損傷，缺氧、氧化應激和營養(yǎng)缺乏，都會干擾ER的功能，繼而導致錯誤折疊或未折疊的蛋白質在ER腔內大量堆積，從而導致ER stress。ER stress激活未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，UPR分別通過激活蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)、肌醇蛋白酶1(IRE1)和活化轉錄因子6(ATF6)三條通路減少蛋白的合成、加快正常蛋白的折疊以及異常蛋白的降解，若UPR失代償則產生細胞損傷[14]。ER stress可以通過激活ATF6、PERK和IRE1三條通路引起炎癥反應、EMT及異常修復機制而引起肺纖維化[13-14]。為進一步明確MT保護機制是否涉及ER stress，我們使用Western blot及免疫組化檢測BLM處理后72 h ER stress相關蛋白表達情況。ER分子伴侶GRP78與ER stress的UPR的三個跨膜蛋白ATF6、PERK和IRE1相結合，維持細胞穩(wěn)態(tài)，當受到外界刺激時，該蛋白與跨膜蛋白解離，激活UPR三條通路，在UPR反應后其本身表達可被上調，是ER stress的敏感蛋白。本研究結果發(fā)現，當給予BLM處理后GRP78表達升高，而給予MT處理后明顯降低了BLM對GRP78的上調作用?？缒さ鞍譖ERK在ER stress反應時通過磷酸化方式激活，使下游eIF2α磷酸化，繼而激活核因子κB(NK-κB)引起炎癥反應，我們通過檢測p-PERK發(fā)現，MT可以明顯抑制BLM誘導的PERK磷酸化水平與分布范圍。IRE1α可通過磷酸化激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路引起炎癥反應，我們的研究也發(fā)現，給予MT后可明顯抑制BLM誘導的IRE1α磷酸化水平與分布范圍。ATF6激活后可通過p38引起炎癥反應，我們觀察了ATF6分布情況，結果發(fā)現給予MT后，ATF6α分布較單純BLM分布減少。我們的以上研究結果表明，在BLM所致小鼠肺纖維化早期MT明顯抑制了ER stress反應的三條通路[13]。

ER stress 激活UPR通路后可分別通過三條通路，引起炎癥反應[5]， ER stress也可引起氧化應激，同時氧化應激和炎癥反應又能進一步加重ER stress[15]。文獻報道[16]MT對肺纖維化形成的保護機制可能與其有抗氧化應激及抗炎癥作用都有關。本研究發(fā)現，MT對BLM所致的小鼠早期損傷的保護作用可能與抑制ER stress有關，但MT是直接通過影響ER stress相關蛋白，還是通過影響氧化應激或炎癥反應繼而間接影響ER stress相關蛋白，抑或通過ER stress、炎癥反應及氧化應激三種機制共同起保護作用，在本研究中并沒有完全闡明，有待進一步研究。因此，根據本研究結果可得出的結論是MT能減輕BLM引起小鼠肺纖維化早期的損傷并抑制ER stress?？傊狙芯筷U明了MT對肺纖維化早期炎癥期的保護作用及其部分機制，為應用于臨床治療提供了新的證據。

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網絡出版時間：2015-1-9 13:37網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.016.html

Melatonin alleviates endoplasmic reticulum stress at an early stage

during bleomycin-induced lung fibrosis in mice

CAO Lin-feng1, ZHAO Hui1, QIN Hou-ying1, ZHANG Cheng2, XU De-xiang2

(1.DeptofRespiratory,theSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China;

2.DeptofToxicology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Abstract:AimTo investigate whether melatonin (MT) can alleviate endoplasmic reticulum(ER) stress at an early stage of bleomycin(BLM)-induced lung fibrosis in mice. MethodsAdult healthy male ICR mice were divided randomly into control group, MT group, BLM group and MT+BLM group. In MT group, mice had saline treatment 30 minutes after having the intraperitoneal injection of MT (10 mg·kg-1) and had been intraperitoneally injected with MT once in the following every 24 hours. In BLM group, mice were intratracheally injected with a single dose of BLM (5 mg·kg-1). In MT+BLM group, mice had been intraperitoneally injected with BLM 30 minutes after having MT and had been injected with MT once in the following every 24 hours. In control group, mice received the same level of saline treatment in the same manner. All mice were dissected for collecting the tissue of lungs at different time points (24h, 72h) after BLM treatment. Inflammatory cell infiltration of lungs was determined by HE staining. The level of ER stress related proteins (GRP78, p-eIF2α, p-IRE1α) in lungs was determined using Western blot. The distribution of ER stress related proteins (GRP78, p-IRE1α, ATF6α, p-PERK) in lungs was detected by immunohistochemistry. ResultsThe model of BLM-induced acute inflammation of lung fibrosis in mice had been successfully constructed. After BLM treatment, lung weight, lung weight ratio and inflammatory cell infiltra tion were significantly increased with a significant correlation between time and effectiveness. After MT treatment, lung weight, lung weight ratio and inflammatory cell infiltration were significantly reduced. The results of Western blot showed that MT pretreatment not only prevented the increase of BLM-induced GRP78 protein significantly, but also restrained the phosphorylation of eIF2α and IRE1α in mouse lungs. Immunohistochemistry also showed that MT pretreatment reduced the expression of GRP78, p-IRE1α, ATF6α and p-PERK. ConclusionMT alleviates ER stress effectively at an early stage of BLM-induced lung fibrosis in mice.

Key words:melatonin; bleomycin; inflammation; lung fibrosis; ER stress; GRP78 protein

通訊作者趙卉(1967-)，男，副教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，研究方向：肺纖維化，，Tel：0551-63869557， E-mail：zhaohuichenxi@126.com

作者簡介：曹林峰(1988-)，男，碩士生，研究方向：肺纖維化，E-mail：88341446@qq.com；

基金項目：國家自然科學基金資助項目 (No 30973544)

收稿日期:2014-10-23,修回日期:2014-11-21

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0227-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.016