李得春(1968~)，男，土族，青海籍，副主任醫(yī)師

TNF-α基因多態(tài)性與藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者預(yù)后

李得春，陸川，張國(guó)秋

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科)

摘要目的檢測(cè)分析TNF-α基因多態(tài)性與藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者預(yù)后的關(guān)系，探討TNF-α在判斷藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核預(yù)后中的價(jià)值。方法采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者血清TNF-α表達(dá)水平，應(yīng)用等位基因特異引物PCR(AS-PCR)分析TNF-α-308、TNF-α-238 位點(diǎn)啟動(dòng)子等位基因多態(tài)性，對(duì)受檢患者進(jìn)行隨訪，分析TNF-α表達(dá)在判斷藏族骨關(guān)節(jié)患者預(yù)后中的價(jià)值。結(jié)果TNF-α在藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者血清中的表達(dá)水平(278.0±39.1ng/L)明顯高于正常對(duì)照組(120.0±41.7ng/L)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；病例組TNF-α-308位點(diǎn)基因型及等位基因頻率與對(duì)照組存在顯著差異(P<0.05)，而TNF-α-238位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者和對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；TNF-α在判斷藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的預(yù)后中具有價(jià)值(P<0.05)。結(jié)論青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中 TNF-α過(guò)度表達(dá)，且TNF-α-308基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病可能存在關(guān)系；TNF-α表達(dá)水平可用來(lái)評(píng)估患者的預(yù)后，可作為藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者預(yù)后的標(biāo)記物。

關(guān)鍵詞骨關(guān)節(jié)結(jié)核腫瘤壞死因子α基因多態(tài)性藏族預(yù)后

中圖分類號(hào)R322.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.002

AbstractObjectiveTo investigate the expression of TNF-α in osteoarticular tuberculosis of Tibetans，to test the associations between TNF-α-gene polymorphisms and OATB susceptibility in Tibetans and to clarify the prognosis value of TNF-α in the Tibetan patients with osteoarticular tuberculosis.Methods To detect the expression level of TNF-α in serum osteoarticular tuberculosis of Tibetans by using ELISA.To develop an allele-specific polymerase chain reaction(AS-PCR)assay to identify the polymorphisms of TNF-α-238 and-308 locus，to clarify the prognosis value of TNF-α in the Tibetan patients with osteoarticular tuberculosis.Results The expression level of TNF-α in Tibetan patients with osteoarticular tuberculosis(278.0±39.1ng/L)was significantly higher than that in normal control group(127±52.2ng/L)，with significant difference(P<0.05).TNF-α-308 locus distributions and their frequencies between the patients and controls show statistical significant.TNF-α-238 locus distributions and their frequencies between the patients and controls had no statistical significant.TNF-α could evaluate prognosis of OATB.Conclusion TNF-α is overexpressed in Tibetan patients with osteoarticular tuberculosis，and TNF-α-308 gene polymorphisms may be associated with susceptibility of OATB，and TNF-α can be used as marker for predicting the prognosis of OATB.

KeywordsOsteoarticular tuberculosisTumor necrosis factor-alphaGenetic susceptibilities TibetanPrognosis

收稿日期2015-01-03

THE RELATIONSHIP BETWEEN THE TUMOR NECROSIS

FACTOR-α GENE POLYMORPHISMS AND PROGNOSIS TO

OSTEOARTICULAR TUBERCULOSIS (OATB) IN TIBETANS

Li Dechun，Lu Chuan，Zhang Guoqiu

(Department of Joint，Qinghai University Affiliated Hospital，Xining 810001，China)

青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病率較高，其原因不明[1]。腫瘤壞死因子(TNF)-α主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是機(jī)體防御外界刺激的重要細(xì)胞因子，對(duì)機(jī)體的免疫細(xì)胞及免疫系統(tǒng)都具有重要作用[2]。TNF-α的基因多態(tài)性受地理環(huán)境、民族的影響。TNF-α基因多態(tài)性與藏族人群骨關(guān)節(jié)結(jié)核關(guān)系的報(bào)道較少且結(jié)論不一。本研究通過(guò)對(duì)青海地區(qū)藏族人群TNF-α基因多態(tài)性在骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)與作用分析，厘清相關(guān)關(guān)系。

1資料與方法

1.1　研究對(duì)象

選取2009年01月～2011年12月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科住院治療的確診為骨關(guān)節(jié)結(jié)核的青海籍81例藏族患者為病例組，其中男44例；平均年齡(42.6±7.8)歲。選取同期本院青海籍55例藏族健康體檢者作為對(duì)照組，其中男36例；平均年齡(38.3±10.2)歲。排除可能影響易感性的患者。將病例組及對(duì)照組受試者的性別、年齡等情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2　研究方法

1.2.1TNF-α水平測(cè)定

采集清晨空腹時(shí)兩組受試者肘靜脈血液標(biāo)本，常溫下30 min內(nèi)離心(2000r/min)10 min，分離上層血清于-20 ℃冰箱保存待用。采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行TNF-α水平測(cè)定，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。試劑盒購(gòu)買于上海生物工程技術(shù)有限公司。

1.2.2TNF-α 308、TNF-α 238基因多態(tài)性分析

將所取受試者空腹的外周靜脈血5 mL，加入EDTA-K2抗凝管中，DNA提取嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并于-20 ℃。試劑盒購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司。采用等位基因特異引物聚合酶鏈反應(yīng)(AS-PCR)分析TNF-α 308、TNF-α 238基因多態(tài)性。根據(jù)NCBI獲取TNF-α基因序列，引物由北京博奧森生物技術(shù)公司合成，TNF-α 308 G/A 引物序列為F：5′-AATAGGTTTTGAGGGGCAAGG-3′，R：5′-AGGGAGCGT CTGCT GGCT G-3′。TNF-α 238 G/A引物序列為F：5′-CCGTGCTTGGTGCTTTGGACTA-3′，R：5′-AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG-3′。根據(jù)所購(gòu)即用型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒構(gòu)成反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為： 94.0 ℃預(yù)變性3 min，94.0 ℃變性1 min，63.3 ℃退火1 min，72.0 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后于72 ℃延伸5 min完成擴(kuò)增；采用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，使用美國(guó)Bio-Rad Gel DOC 2000凝膠電泳成像分析系統(tǒng)確定啟動(dòng)子等位基因及基因型。TNF-α-308位點(diǎn)等位基因和基因型的鑒定：PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)135 bp條帶為GG基因型(野生型純合子)、360 bp條帶為AA基因型(野生型純合子)，135 bp、360 bp條帶同時(shí)出現(xiàn)為GA基因型(突變型雜合子)；TNF-α 238位點(diǎn)等位基因與基因型的鑒定：PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)206 bp條帶為GG基因型(野生型純合子)、287 bp條帶為AA基因型(野生型純合子)，206 bp、287 bp條帶同時(shí)出現(xiàn)為GA基因型(突變型雜合子)。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1　血清TNF-α水平

骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者血清中TNF-α表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。其平均表達(dá)量為(278.0±39.1)ng/L，其中表達(dá)量高于平均水平者為高表達(dá)，共42人；表達(dá)量低于平均水平者為低表達(dá)，共39人。

表1　骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者與對(duì)照組血清中TNF-α表達(dá)水平的比較結(jié)果(ng/L， ± s)

Table 1　Serum TNF-α levels in bone & joints TB patients and control (ng/L， ± s)

表1　骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者與對(duì)照組血清中TNF-α表達(dá)水平的比較結(jié)果(ng/L， ± s)

組別男性nTNF-α含量女性nTNF-α含量合計(jì)nTNF-α含量病例組44276.0±49.337280.0±50.081278.0±39.1對(duì)照組36119.0±55.919121.0±52.655120.0±41.7t13.3411.0722.51P<0.01<0.01<0.01

2.2　TNF-α-308、TNF-α-238位點(diǎn)啟動(dòng)子等位基因及基因型頻率比較結(jié)果

病例組與對(duì)照組TNF-α- 308位點(diǎn)等位基因與基因型頻率相比較具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。病例組與對(duì)照組TNF-α-238位點(diǎn)等位基因與基因型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表3)。

表2　TNF-α-308位點(diǎn)等位基因及基因型頻率比較[ n(%)]

表3　TNF-α-238位點(diǎn)等位基因及基因型頻率比較[ n(%)]

3討論

關(guān)于不同地域、種族、民族之間TNF-α基因多態(tài)性與骨關(guān)節(jié)結(jié)核的關(guān)系的研究已有報(bào)道，多數(shù)研究結(jié)果顯示TNF-α-308、TNF-α-238位點(diǎn)基因具有多態(tài)性，但結(jié)果不盡相同[3-4]。研究表明，TNF-α能結(jié)合破骨細(xì)胞前體細(xì)胞上的相應(yīng)受體，不同程度地調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化、激活和凋亡[5]，增強(qiáng)破骨細(xì)胞的功能，促進(jìn)其破壞骨質(zhì)的能力。也有研究表明，TNF-α基因多態(tài)性影響TNF-α產(chǎn)物的表達(dá)，不同基因型的TNF-α可以產(chǎn)生不同的蛋白，從而導(dǎo)致疾病類型的不同以及疾病嚴(yán)重程度的不同，然而目前對(duì)TNF-α基因多態(tài)性于骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病的研究報(bào)道較少，且大多報(bào)道只闡明了TNF-α在骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者血清中的表達(dá)水平，其表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系研究很少。尤其對(duì)青海地區(qū)藏族。青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病率高，TNF-α基因多態(tài)性在青海地區(qū)藏族人群中骨關(guān)節(jié)結(jié)核發(fā)病、發(fā)展及預(yù)后中的作用有待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)青海地區(qū)藏族人群中骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者TNF-α-308、TNF-α-238等位基因及基因型進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果顯示，TNF-α在骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者血清中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，提示其表達(dá)量與骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病相關(guān)；病例組和對(duì)照組TNF-α-308位點(diǎn)基因型的分布頻率存在顯著差異，青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患TNF-α-308位點(diǎn)G/A、A/A基因型頻率明顯高于對(duì)照組；青海地區(qū)藏族骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者TNF-α-308 A等位基因頻率也明顯高于對(duì)照組。表明青海地區(qū)藏族人群中骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者TNF-α-308 A的表達(dá)水平明顯高于正常人，提示TNF-α-308 A等位基因高表達(dá)的藏族人群可能更易于感染骨關(guān)節(jié)結(jié)核，其表達(dá)水平與骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病率呈正相關(guān)。此外，研究結(jié)果提示TNF-α-308位點(diǎn)基因多態(tài)性與藏族人群骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病可能存在一定的正相關(guān)性，這與林春燕等[6]的研究結(jié)果具有相似性；而TNF-α-238位點(diǎn)等位基因及基因型分布頻率在病例組和對(duì)照組中無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明TNF-α-238位點(diǎn)基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族人群骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)性。除此之外，本研究還對(duì)進(jìn)行手術(shù)治療的骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者進(jìn)行密切隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α表達(dá)水平較低的骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者術(shù)后出現(xiàn)疼痛或復(fù)發(fā)的時(shí)間明顯晚于TNF-α高表達(dá)的骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者，即TNF-α表達(dá)水平越低，患者的預(yù)后越好，反之亦然。TNF-α表達(dá)水平與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TNF-α的表達(dá)水平對(duì)判斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者的預(yù)后具有指導(dǎo)意義，可能是骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者預(yù)后不良的標(biāo)記物。檢測(cè)TNF-α表達(dá)水平對(duì)指導(dǎo)臨床用藥量、用藥時(shí)間具有一定的作用。

綜上所述，青海地區(qū)藏族人群骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中TNF-α表達(dá)水平明顯增高，并且TNF-α-308基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族人群骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病率呈正相關(guān)；TNF-α的表達(dá)對(duì)評(píng)估患者的預(yù)后、指導(dǎo)臨床用藥具有一定價(jià)值，這也是本研究較以往報(bào)道的不同之處。但本研究屬于單中心的研究，且樣本量較小，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)過(guò)程中難免出現(xiàn)偏倚，其TNF-α用于判斷患者的預(yù)后的可信度需要多中心大樣本的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

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