※：青海大學(xué)中青年科研基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2011-QYY-6)

曹學(xué)鋒(1977～)，男，漢族，甘肅籍，副教授

血紅素氧合酶-1在低氧條件下對(duì)大鼠腎缺血-再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制※

曹學(xué)鋒，劉杰，王生蘭，劉輝琦，文建軍

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

摘要目的探討血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)在低氧預(yù)適應(yīng)時(shí)對(duì)大鼠腎缺血-再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。方法建立大鼠的腎缺血-再灌注損傷動(dòng)物模型，觀察大鼠再灌注后腎臟免疫組織化學(xué)變化；檢測(cè)HO-1基因在大鼠腎臟的表達(dá)情況。并就上述結(jié)果行相關(guān)分析。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，CoPP組HO-1mRNA表達(dá)量最高，其余依次降低為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、低氧+ZnPP組、低氧組，差異有顯著性(P<0.01)。CoPP組SOD活性最高，其余依次為低氧組、ZnPP組，差異有顯著性(P<0.05)。CoPP組MDA含量最低，其余依次升高為低氧組、低氧+ZnPP組、ZnPP組，差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論經(jīng)鈷原卟啉(CoPP)處理和低氧預(yù)適應(yīng)使HO-1表達(dá)增強(qiáng)，腎臟缺血-再灌注時(shí)的細(xì)胞損傷減輕，其機(jī)制可能與降低氧自由基損傷相關(guān)。

關(guān)鍵詞血紅素氧合酶-1腎缺血-再灌注損傷低氧預(yù)適應(yīng)氧自由基

中圖分類號(hào)R363

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.004

AbstractObjectiveTo investigate the protective effects of heme oxygenase-1(HO-1)in Renal ischemia/reperfusion injury on rats under hypoxia and explore the possible mechanism.Methods Rat renal ischemia/reperfusion injury model was established.The expression of HO-1 mRNA was detected by RT-PCR.The vitality of SOD and the quantity of MDA were detected in rat renal ischemia/reperfusion injury models treated with HO-1 inducer cobalt protoporphyrin(CoPP)，zinc protoporphyrin(ZnPP，HO-1 inhibitor)and hypoxic preconditioning.Results HO-1 mRNA level expression results showed that：compared with normal control group，the CoPP group expression was the highest，the other groups such as control group，hypoxia+ZnPP group，hypoxia group，also showed significant difference(P<0.01).SOD activity in CoPP group was the highest，followed with low oxygen and ZnPP group，respectively，showed significant difference(P<0.05).MDA content in CoPP group was the lowest，while the hypoxia，hypoxia+ZnPP group and ZnPP group showed significant difference(P<0.05) as well.Conclusion The up regulation of HO-1 expression induced by CoPP and hypoxic preconditioning can reduce the degree of damage of the tubular epithelial cells and subsequently alleviate the renal ischemia reperfusion injury.One of its main mechanisms may be related with anti oxygen free radicals.

Keywordsheme oxygenase-1renal ischemic /reperfusion injuryhypoxic preconditioningoxygen free radical

收稿日期2015-04-02

THE PROTECTIVE EFFECT OF HEME OXYGENASE-1 IN

RENAL ISCHEMIA/REPERFUSION INJURY ON

RATS UNDER HYPOXIA

Cao Xuefeng，Liu Jie，Wang Shenglan，Liu Huiqi，Wen Jianjun

(Qinghai University Medical College，Xining QingHai，810001)

近年來腎缺血-再灌注損傷(renal ischemia repergusion injury，RIRI)保護(hù)機(jī)制成為器官移植研究熱點(diǎn)。血紅素氧合酶-1(HO-1)是降解血紅素的限速酶和關(guān)鍵酶，HO-1的保護(hù)效應(yīng)是通過其降解產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)的[1-2]。本實(shí)驗(yàn)采用HO-1抑制劑和誘導(dǎo)劑處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，觀察HO-1在腎臟缺血-再灌注損傷模型中的表達(dá)，進(jìn)而探討HO-1 在腎臟缺血-再灌注損傷中的作用和機(jī)制。

1對(duì)象與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)對(duì)象和分組

健康SD雄性大鼠60只隨機(jī)分為6組，每組10只，體重(200±30)g，由甘肅省中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。分組：(1)正常對(duì)照組：術(shù)前24 h 腹腔注射生理鹽水；(2)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：術(shù)前切除右腎，夾閉左腎動(dòng)脈缺血1 h，而后再灌注3 h；(3)CoPP組，于實(shí)驗(yàn)前24 h腹腔注射CoPP(5mg/ kg)，余同(2)組處理；(4)ZnPP組，于實(shí)驗(yàn)前24 h 腹腔注射ZnPP(5mg/kg)，余同(2)組處理；(5)低氧組，實(shí)驗(yàn)前24 h，放入低壓氧倉(cāng)(海拔4000m)，余同(2)組處理；(6)低氧+ZnPP組，于實(shí)驗(yàn)前24 h腹腔注射ZnPP(5mg/kg)并放入低壓氧倉(cāng)(海拔4000 m)，余同(2)組處理。

1.2　主要試劑

鈷原卟啉(CoPP) 、鋅原卟啉(ZnPP)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；免疫組化試劑盒購(gòu)于武漢BOSTER公司；RT-PCR實(shí)驗(yàn)cDNA第一鏈合成試劑盒等均購(gòu)于北京TIANGEN公司。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)本采集及處理

各組大鼠于缺血-再灌注后處死，取出腎臟組織，4%多聚甲醛固定和-80 ℃冰箱冷凍。

1.3.2免疫組化實(shí)驗(yàn)

按照免疫組化試劑盒說明進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)操作，免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：胞漿染色呈棕黃色顆粒為HO-1陽(yáng)性反應(yīng)，不著色為陰性。

1.3.3RT-PCR實(shí)驗(yàn)

從冰箱取重量約0.1 g腎組織，使用Trizol總RNA提取試劑盒，RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。HO-1 的上游引物：5′-AGCATGTCCCAGGATTTG-3′，下游引物：5′-GCTCAATGTTGAGCACA-3′，擴(kuò)增目的片段為615 bp。擴(kuò)增內(nèi)參為β-actin，上游引物：5′-TGGATGATGATATCGCCGCCG-3′，下游引物：5′-CTAGATGGGCACAGAGTGTGGCA-3′，目的基因擴(kuò)增片段為501 bp。反應(yīng)程序設(shè)定：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性40 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min ，共35個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)RT-PCR實(shí)驗(yàn)相對(duì)定量HO-1基因表達(dá)情況，制作內(nèi)參基因和HO-1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算斜率并得出擴(kuò)增效率，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2(-ΔΔCt)法計(jì)算出HO-1mRNA的相對(duì)定量。

1.3.4超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量測(cè)定

將所取腎組織制作10%腎組織勻漿溶液，離心后吸取上清液，使用SOD檢測(cè)試劑盒(WST法)檢測(cè)SOD活性，以硫代巴比妥酸(Thibabituric Acid，TBA)比色分析法測(cè)定MDA含量，分光光度計(jì)定量測(cè)定。其操作步驟和公式計(jì)算均嚴(yán)格按照試劑盒使用說明進(jìn)行。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

鏡下見各組腎組織均有HO-1的表達(dá)，HO-1主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞，胞漿中含棕黃色顆粒為表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞；與正常對(duì)照組相比，CoPP組表達(dá)顯著增強(qiáng)，低氧組次之，而ZnPP組表達(dá)相對(duì)降低(圖1)。

AB

CD

A：正常對(duì)照組B：CoPP組C：低氧組D：ZnPP組

圖1免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性結(jié)果圖(×40)

Figure 1Positive results of immunohistochemical staining (×40)

A：Normal groupB：CoPP model groupC：ZnPP model groupD：hypoxic preconditioning group

2.2　HO-1mRNA表達(dá)結(jié)果

HO-1mRNA水平表達(dá)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、CoPP組、低氧組和低氧+ZnPP組表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組，差異有顯著性(P<0.01)；與CoPP組相比較，ZnPP組、低氧組、低氧+ZnPP組表達(dá)量明顯較高(P<0.01，見表1)。

表1　各組大鼠腎組織HO-1 mRNA表達(dá)比較( ± s)

Table 1　Comparison of rats kidney HO-1 mRNA expression among six groups( ± s)

表1　各組大鼠腎組織HO-1 mRNA表達(dá)比較( ± s)

組別nHO-1mRNA正常對(duì)照組100.44±0.09實(shí)驗(yàn)對(duì)照組100.67±0.08aCoPP組101.19±0.12abZnPP組100.42±0.06bC低氧組100.55±0.05abc低氧+ZnPP組100.66±0.08aC

注：a表示與正常對(duì)照組比較P<0.01，b表示與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較P<0.01，c表示與CoPP組比較P<0.01.

2.3　各組腎組織中SOD活性和MDA含量

SOD活性正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、CoPP組、ZnPP組相比較明顯升高(P<0.05)，CoPP組與ZnPP組、低氧組比較有顯著性(P<0.05)，而與低氧+ZnPP組相比較沒有顯著性。MDA含量正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、CoPP組、ZnPP組、低氧組、低氧+ZnPP組比較有顯著性(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與CoPP組、ZnPP組、低氧組、低氧+ZnPP組比較有顯著性(P<0.05，表2)。

表2　各組腎組織SOD活性和MDA含量的變化( ± s)

Table 2　The changes of SOD activity and MDA contents in the renal tissue( ± s)

表2　各組腎組織SOD活性和MDA含量的變化( ± s)

組別nSOD(nu/mg-prot)MDA(nmol/mgprot)正常對(duì)照組1094.32±23.214.52±5.2實(shí)驗(yàn)對(duì)照組10126.56±32.4a29.42±7.3aCoPP組10176.33±36.1ab14.78±4.8bZnPP組10132.14±22.2ac38.81±5.6abc低氧組10143.22±26.1ac20.67±8.2abc低氧+ZnPP組10165.12±35.8ab26.88±6.7ac

注：a表示與正常對(duì)照組比較P<0.05，b表示與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較P<0.05，c表示與CoPP組比較P<0.05.

3討論

腎移植過程中供腎缺血后再灌注時(shí)易產(chǎn)生大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，其導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)、線粒體腫脹、溶酶體膜破壞，活性氧間接調(diào)控調(diào)亡相關(guān)基因表達(dá)，誘導(dǎo)移植器官發(fā)生細(xì)胞調(diào)亡，最終導(dǎo)致移植器官功能降低甚至喪失[3]。

HO-1是HO家族成員之一，屬于誘導(dǎo)型，其可被多種有害刺激包括血紅素、高氧、 缺氧、一氧化氮等誘導(dǎo)產(chǎn)生高表達(dá)；HO-1降解血紅素產(chǎn)生膽紅素、一氧化碳和鐵；這些產(chǎn)物具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗增殖等效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用HO-1誘導(dǎo)劑可顯著減輕腎小球腎炎病程中的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和蛋白尿、腎小球血栓形成及腎小管損害[4-5]。Chok[6]等在大鼠腎臟缺血45 min后再灌注l h和24 h后，結(jié)果表明HO-1降低了腎小管的壞死程度，并且發(fā)現(xiàn)其損傷程度與半胱氨酸蛋白酶-3、微粒體前列腺素E合酶、C0X-2的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)；缺血-再灌注損傷減輕其可能機(jī)制是通過減弱炎癥浸潤(rùn)而發(fā)揮保護(hù)作用。HO-1還能夠通過上調(diào)細(xì)胞周期從而抑制蛋白p21來影響腎小管上皮細(xì)胞周期從而阻止細(xì)胞凋亡[7]，還可通過阻止細(xì)胞自我吞噬從而減輕腎小管損傷[8]。

據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)采用夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈的方法制備大鼠腎缺血-再灌注動(dòng)物模型，觀察HO-1在腎缺血-再灌注損傷中的作用。并測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組腎組織SOD活性及MDA含量，從而對(duì)HO-1在腎缺血-再灌注中的作用和機(jī)制進(jìn)行了探討。腎臟缺血-再灌注后，氧自由基生成大量增加，而SOD對(duì)自由基不能有效清除，致大量氧自由基堆積，因此SOD活性高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。自由基攻擊膜脂質(zhì)并發(fā)生氧化， 脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)升高，依此測(cè)定腎臟MDA含量， 可間接反映體內(nèi)自由基膜脂質(zhì)過氧化程度[9-10]。

本次實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，SOD活性CoPP組明顯升高，CoPP組與 ZnPP組、低氧組比較有顯著性(P<0.05)，而與低氧+ZnPP組比較沒有顯著性，相對(duì)應(yīng)的SOD活性較高組其MDA含量明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果也顯示差異具有顯著性。同時(shí)CoPP組免疫組化結(jié)果表明在腎組織HO-1表達(dá)也明顯升高，說明SOD在減輕再灌注損傷方面有積極作用；而ZnPP組因再灌注前使用HO-1抑制劑，抑制了HO-1表達(dá)，其抗氧化機(jī)制減弱，腎組織MDA含量明顯增高，表明缺血-再灌注后大量自由基攻擊生物膜，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，產(chǎn)生大量氧化產(chǎn)物丙二醛；同時(shí)自由基增多，使SOD在清除自由基過程中消耗增加，SOD活力下降，進(jìn)一步說明HO-1誘導(dǎo)劑和低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)腎缺血-再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)可能是通過抗氧化機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

其次RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CoPP組與低氧組相比較，HO-1mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，表明低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)于促進(jìn)HO-1表達(dá)沒有CoPP強(qiáng)烈。ZnPP組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，腎組織中MDA含量明顯升高(P<0.01)，提示ZnPP抑制劑通過抑制HO-1表達(dá)使腎缺血-再灌注損傷時(shí)自由基對(duì)腎組織的損傷加重。

綜上所述，一定時(shí)間的低氧預(yù)適應(yīng)和使用HO-1誘導(dǎo)劑具有拮抗自由基介導(dǎo)的組織細(xì)胞氧化損傷作用。

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