陳雪峰， 王貴春， 劉　寧， 王　寧

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

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鹽脅迫發(fā)菜胞外多糖的抗氧化活性

陳雪峰， 王貴春， 劉寧， 王寧

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安710021)

摘要：通過(guò)對(duì)液體培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞進(jìn)行鹽脅迫處理，研究了鹽脅迫對(duì)發(fā)菜胞外多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗氧化活性的影響.在光照強(qiáng)度60 μmol·m-2s-1、光暗比12∶12、溫度白天25 ℃及夜晚10 ℃等條件下，采用BG-110培養(yǎng)液培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞，0.3 mol/L的NaCl脅迫處理發(fā)菜細(xì)胞，水溶醇沉法提取正常及鹽脅迫下發(fā)菜胞外多糖，經(jīng)純化后進(jìn)行紅外光譜分析和抗氧化活性測(cè)定，并分析了發(fā)菜胞外多糖對(duì)鹽脅迫的響應(yīng).結(jié)果表明：紅外光譜分析兩種發(fā)菜胞外多糖樣品，其特征吸收峰基本一致；兩種培養(yǎng)條件下的胞外多糖抗氧化能力均呈現(xiàn)量效關(guān)系，且YEPS活性高于NEPS.

關(guān)鍵詞：發(fā)菜； 胞外多糖； 鹽脅迫； 抗氧化活性

0引言

多糖是一類具有多種生物活性的大分子物質(zhì)，具有保濕、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等功能，已有將各種多糖應(yīng)用于食品、醫(yī)藥中的研究報(bào)道.例如，普魯蘭多糖、黃原膠、香菇多糖等作為天然活性成分用于食品、藥品行業(yè)[1-3].發(fā)菜是發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc Flagelliforme)的俗稱，是一種重要的陸生藍(lán)藻.發(fā)菜胞外多糖由發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中向胞外分泌，包裹于細(xì)胞及藻絲體外，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用，使其能抵御外部惡劣的生長(zhǎng)環(huán)境，同時(shí)還具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等生物活性[4]，具有極高的藥用價(jià)值和開(kāi)發(fā)潛力.

近年來(lái)，發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視.藻細(xì)胞在逆境脅迫條件下，其形態(tài)、功能及抗逆活性物質(zhì)等產(chǎn)生了相應(yīng)變化.Han等[5]研究了不同波長(zhǎng)對(duì)發(fā)菜莢膜多糖和胞外多糖產(chǎn)生的影響，兩類多糖產(chǎn)量明顯增加，但其單糖組成等在不同光波長(zhǎng)下存在顯著性差異;趙學(xué)敏等[6]對(duì)發(fā)狀細(xì)胞進(jìn)行了不同濃度的鹽脅迫處理，研究結(jié)果顯示其正常生理活性受到抑制而表現(xiàn)出一定的抗逆能力，對(duì)鹽脅迫具有一定的耐受性；進(jìn)一步的研究表明，發(fā)菜光合速率與葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度隨NaCl濃度的升高先增加后降低，向培養(yǎng)液中添加外源硝酸鹽后可以緩解NaCl對(duì)發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)物的生理脅迫效應(yīng)，增強(qiáng)其抗鹽性.

目前,就發(fā)菜細(xì)胞鹽脅迫的報(bào)道主要集中在鹽脅迫對(duì)細(xì)胞形態(tài)和光合作用的影響，而發(fā)菜胞外多糖對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)則有待深入研究.本課題組前期研究表明，發(fā)菜細(xì)胞處于鹽脅迫環(huán)境時(shí)，胞外多糖的分泌量較常規(guī)培養(yǎng)增加了50.3%.基于此，本文以液培發(fā)菜細(xì)胞為材料，研究了鹽脅迫對(duì)發(fā)菜胞外多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗氧化活性的影響，從而為生產(chǎn)高活性的生物多糖提供了新方法、新思路.

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

(1)主要儀器：Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；VERTE70型傅立葉紅外光譜分析儀，德國(guó)Bruker公司.

(2)主要試劑：偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)，美國(guó)Sigma公司；2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，美國(guó)Sigma公司；過(guò)硫酸鉀(K2S2O8)，天津市科密歐試劑有限公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，美國(guó)Sigma公司；水溶性維生素E(Trolox)，美國(guó)Sigma公司；熒光素鈉鹽(FL)，美國(guó)Sigma公司.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1發(fā)菜鹽脅迫處理

無(wú)菌條件下離心收集指數(shù)生長(zhǎng)末期的發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞，重新接種于氯化鈉濃度為0.3 mol/L的BG-110培養(yǎng)液中.對(duì)照組不含氯化鈉.在光照強(qiáng)度60μmol·m-2s-1、光暗比12∶12、溫度白天25 ℃及夜晚10 ℃條件下，連續(xù)培養(yǎng)6天.

培養(yǎng)結(jié)束后，參照陳雪峰等[7]的研究方法，對(duì)兩種環(huán)境下發(fā)菜胞外多糖進(jìn)行提取純化、冷凍干燥后，得白色絮狀多糖樣品.正常環(huán)境及鹽脅迫環(huán)境下發(fā)菜胞外多糖純化物分別命名為NEPS、YEPS，用于紅外光譜分析及活性測(cè)定.

1.2.2紅外光譜分析

稱取多糖樣品，與充分干燥的溴化鉀混合壓片，在4 000～600 cm-1區(qū)間內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描.

1.2.3發(fā)菜胞外多糖清除氧自由基能力(ORAC值)

抗氧化能力指數(shù)(Oxygen Radical Absorbance Capacity，ORAC)，是目前抗氧化研究領(lǐng)域中為人們所關(guān)注的一個(gè)評(píng)價(jià)方法.該方法以偶氮類化合物AAPH作為過(guò)氧自由基來(lái)源、熒光素鈉作為熒光指示劑、維生素E水溶性類似物Trolox作為定量標(biāo)準(zhǔn)，使用酶標(biāo)儀進(jìn)行分析[8-10].

在96孔板的各微孔中分別加入緩沖溶液、樣品(4 mg/mL)及FL各20μL后，在37 ℃下孵育15 min，迅速在各孔中加入新配制的12.8 mmol/L的AAPH 140μL啟動(dòng)反應(yīng)；將96微孔板放入酶標(biāo)儀后運(yùn)行程序，在37 ℃下以激發(fā)波長(zhǎng)485 nm、發(fā)射波長(zhǎng)538 nm 進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，每2 min 測(cè)定一次各孔熒光強(qiáng)度，測(cè)定120 min；以不添加自由基的FL熒光自然衰減(-AAPH)和不添加抗氧化劑的自由基熒光自然衰退(+AAPH)為空白對(duì)照，計(jì)算抗氧化劑保護(hù)面積AUC，用AUC 值與Trolox 濃度建立線性回歸方程[10]，再根據(jù)線性回歸方程計(jì)算ORAC值，ORAC值以μmol Trolox /mg 表達(dá).

1.2.4發(fā)菜胞外多糖清除ABTS自由基能力

ABTS自由基儲(chǔ)備液的制備可參照盧茳虹等[9]的實(shí)驗(yàn)方法.ABTS自由基儲(chǔ)備液的制備過(guò)程是:將ABTS和K2S2O8分別用去離子水溶解并混合，使其終濃度分別為14 mmol/L和4.9 mmol/L，室溫避光條件下靜置12～16 h.測(cè)定時(shí)，以50%乙醇稀釋ABTS自由基儲(chǔ)備液，使其在734 nm處吸光值A(chǔ)0為0.702，形成ABTS自由基測(cè)定液.取2.9 mL ABTS自由基測(cè)定液，各加入0.1 mL不同濃度發(fā)菜胞外多糖溶液，混勻后反應(yīng)20 min ，測(cè)定734 nm處吸光值A(chǔ)x.以不同濃度BHT對(duì)ABTS自由基的清除作用作為陽(yáng)性對(duì)照.

發(fā)菜胞外多糖對(duì)ABTS自由基清除能力用清除率R表示：

IC50值是自由基清除率R為50%時(shí)樣品的濃度.

1.2.5發(fā)菜胞外多糖還原力的測(cè)定

取0.4 mL不同濃度待測(cè)液、1.0 mL pH 6.6的磷酸鹽緩沖液及1.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液，迅速混勻，避光條件下，50 ℃水浴保溫反應(yīng)20 min，然后加入1.0 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻后10 000 r/min離心5 min，取2.5 mL上清液，再加入2.5 mL超純水和0.5 mL 0.1%FeCl3，常溫靜置反應(yīng)5 min后,于700 nm處測(cè)定其吸光值.超純水替代0.1%FeCl3作為空白對(duì)照[11,12].

2結(jié)果與討論

2.1鹽脅迫對(duì)發(fā)菜胞外多糖紅外光譜的影響

紅外吸收光譜是目前解析糖類化合物結(jié)構(gòu)的重要手段之一.根據(jù)糖類化合物紅外光譜圖上呈現(xiàn)的特殊吸收，可以判斷糖鏈上的主要取代基、官能團(tuán)類型、糖環(huán)構(gòu)型和糖苷鍵連接方式等結(jié)構(gòu)信息.紅外光譜工作范圍是4 000～400 cm-1，常見(jiàn)官能團(tuán)均能在該區(qū)域產(chǎn)生吸收帶.一般而言，3 600～3 200 cm-1區(qū)為糖類分子內(nèi)羥基O-H鍵的特征吸收峰;1 600 cm-1附近的吸收峰為CHO中C=O的吸收;1 400 cm-1附近的吸收峰為C-H 的變角振動(dòng)吸收，是糖類化合物的特征吸收峰，是判斷未知化合物是否為糖類的重要依據(jù);全譜中最強(qiáng)的吸收峰出現(xiàn)在1 200～1 000 cm-1區(qū)間，由C-O-H和糖環(huán)C-O-C的兩種C-O鍵伸縮振動(dòng)所引起的;1 000 cm-1以下為指紋區(qū)，用于判斷糖聚物的類型和構(gòu)型[13-15].

圖1為不同培養(yǎng)條件下發(fā)菜胞外多糖紅外光譜圖，兩種發(fā)菜胞外多糖樣品分析結(jié)果如表1所示.由此可知，NEPS與YEPS的特征吸收峰基本一致，兩者在810 cm-1、1 614 cm-1附近的吸收峰相似，可以斷定均有α-D-吡喃甘露糖及糖醛酸的存在.此外，在1 240 cm-1和1 140 cm-1處無(wú)S=O和S-O-S基團(tuán)的特征吸收峰，說(shuō)明NEPS與YEPS均為非硫酸化多糖.

(a) NEPS紅外光譜圖

(b)YEPS紅外光譜圖圖1　不同環(huán)境下發(fā)菜胞外多糖紅外光譜圖

吸收波數(shù)/cm-1NEPSYEPS振動(dòng)方式或官能團(tuán)33273373O-H鍵的伸縮振動(dòng)16241606CHO中C=O鍵的伸縮振動(dòng)14131419糖類C-H鍵的變角振動(dòng)10891126C-O鍵的伸縮振動(dòng)806810α-吡喃環(huán)的對(duì)稱伸縮振動(dòng)

2.2鹽脅迫對(duì)發(fā)菜胞外多糖抗氧化活性的影響

2.2.1鹽脅迫對(duì)發(fā)菜胞外多糖氧自由基清除能力(ORAC值)的影響

比較不同培養(yǎng)條件下發(fā)菜胞外多糖NEPS與YEPS氧自由基清除能力，其結(jié)果如圖2所示.根據(jù)計(jì)算可得，NEPS與YEPS的ORAC 值分別為39.68μmol Trolox/mg和98.96μmol Trolox/mg.兩種培養(yǎng)條件下發(fā)菜胞外多糖均具有較好的氧自由基清除能力，但YEPS的ORAC 值明顯高于NEPS，約為NEPS的2.5倍.這說(shuō)明鹽脅迫處理可以明顯提高發(fā)菜胞外多糖清除氧自由基的能力.

圖2　NEPS與YEPS清除氧自由基的能力

2.2.2鹽脅迫對(duì)發(fā)菜胞外多糖ABTS自由基清除能力的影響

比較不同培養(yǎng)條件下發(fā)菜胞外多糖NEPS與YEPS的ABTS自由基清除能力，其結(jié)果如圖3所示.可以看出，NEPS與YEPS均具有清除ABTS自由基的能力，且與多糖濃度成正相關(guān)性.當(dāng)多糖濃度為4.0 mg/mL 時(shí)，NEPS與YEPS的ABTS自由基清除能力分別為50.43%和57.55%.抗氧化劑BHT顯示出了極高的清除ABTS自由基能力，在濃度為0.25 mg/mL時(shí)，ABTS自由基清除能力已達(dá)99.43%.

比較BHT及樣品的ABTS自由基清除能力IC50值可知，BHT(其IC50 值為0.13 mg/mL)的自由基清除能力最強(qiáng)；其次是YEPS(其IC50值為2.68 mg/mL)；最弱為NEPS(其IC50值為3.76 mg/mL).通過(guò)樣品的ABTS自由基清除能力IC50值可以看出，鹽脅迫處理可以明顯提高發(fā)菜胞外多糖清除ABTS自由基能力.

圖3　NEPS與YEPS清除ABTS自由基的能力

2.2.3鹽脅迫對(duì)發(fā)菜胞外多糖還原力的影響

抗氧化劑能夠通過(guò)自身的還原作用給出電子使自由基變成穩(wěn)定的分子，從而失去活性[16]；還原力越強(qiáng)，反應(yīng)液吸光值越大，抗氧力就越強(qiáng).因此，可根據(jù)反應(yīng)液吸光值的大小來(lái)評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力.

如圖4所示，NEPS與YEPS的還原力與多糖濃度有一定的相關(guān)性，兩者均隨著濃度的增加而增強(qiáng).當(dāng)多糖樣品濃度為4.0 mg/mL時(shí)，NEPS與YEPS的還原力分別為0.331、0.365，鹽脅迫處理下得到的發(fā)菜胞外多糖還原力增加了10.3%.造成兩種培養(yǎng)條件下胞外多糖具有不同抗氧化活性的原因，與其具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，糖苷鍵連接方式、單糖組成等都會(huì)對(duì)抗氧化活性產(chǎn)生影響.

圖4　NEPS與YEPS的還原力

3結(jié)論

通過(guò)對(duì)鹽脅迫及正常環(huán)境培養(yǎng)的發(fā)菜胞外多糖進(jìn)行提取純化，研究了鹽脅迫對(duì)發(fā)菜胞外多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗氧化活性的影響.

紅外光譜分析表明，兩者的特征吸收峰基本一致，均有α-D-吡喃甘露糖及糖醛酸的存在，且為非硫酸化多糖；抗氧化活性研究結(jié)果顯示，NEPS與YEPS均具有一定的抗氧化活性，但YEPS的抗氧化活性明顯高于NEPS.這說(shuō)明鹽脅迫處理可以明顯提高發(fā)菜胞外多糖的抗氧化活性，為獲取高活性的微生物多糖提供了新的思路和方法.

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The antioxidant activity of nostoc flagelliforme

extracellular polysaccharide under salt stress

CHEN Xue-feng, WANG Gui-chun, LIU Ning, WANG Ning

(College of Life Science and Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:The effects of salt stress on the chemical structure and antioxidant activity of nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide in liquid culture were demonstrated in this study.The result of nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide was analyzed under the stress.The modified BG-110culture medium containing NaCl of 0.3 mol/L was used to cultivate nostoc flagelliforme cell at light intensity of 60 μ mol·m-2s-1,dimming ratio 12∶12,the temperature during the day 25 ℃,10 ℃ at night.The polysaccharide was precipitated by ethanol.Functional groups and antioxidant activity were analyzed.The IR analysis of NEPS and YEPS were basically the same characteristic absorption peaks.The antioxidant of NEPS and YEPS showed dose-effect relationship,and YEPS had higher activity than NEPS.

Key words:nostoc flagelliforme; extracellular polysaccharide; salt stress; antioxidant activity

中圖分類號(hào)：TS207.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-5811(2015)01-0122-04

作者簡(jiǎn)介:陳雪峰(1964-)，男，陜西寶雞人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品功能成分及生物技術(shù)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31401633); 陜西科技大學(xué)國(guó)家基金后補(bǔ)助項(xiàng)目(2014XHBZ-10)

收稿日期:*2014-10-11