芝麻素對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原分泌的影響

曹雨朦1,鄭書(shū)國(guó)2,趙夢(mèng)秋2,任尤楠2,涂鵬程1,李方圓1,陳雪祎1,常雪允1

(皖南醫(yī)學(xué)院1.臨床醫(yī)學(xué)院;2.藥理學(xué)教研室,安徽蕪湖241002)

【摘要】目的：觀察芝麻素對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞(CF)增殖及膠原分泌的影響，并探討其可能機(jī)制。方法：應(yīng)用雙酶消化和差速貼壁法獲得純化的心肌成纖維細(xì)胞，采用MTT法測(cè)定芝麻素對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖的影響，羥脯氨酸法測(cè)定膠原含量，ELISA法測(cè)定轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)水平，比色法測(cè)定細(xì)胞總抗氧化能力(T-AOC)及丙二醛(MDA)含量。結(jié)果：芝麻素可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖和膠原分泌，抑制TGF-β1表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，同時(shí)可提高細(xì)胞抗氧化能力，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：芝麻素可明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，其機(jī)制可能與提高成纖維細(xì)胞的抗氧化能力、減少氧化損傷、下調(diào)TGF-β1蛋白表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】芝麻素；心肌成纖維細(xì)胞；血管緊張素Ⅱ；氧化應(yīng)激

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】【中圖號(hào)】R 285.5A

DOI【】10.3969/j.issn.1002-0217.2015.02.002

文章編號(hào)：1002-0217(2015)02-0110-04

基金項(xiàng)目：皖南醫(yī)學(xué)院中青年科研

收稿日期：2014-06-10

作者簡(jiǎn)介：張銀昌(1983-)，男，主治醫(yī)師，(電話)15178548583，(電子信箱)zhangyinchang_0216@163.com；

通訊作者王強(qiáng)，男，副主任醫(yī)師，博士，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱)879870162@qq。com，.

Effect of sesamin on collagen secretion and cardiac fibroblasts proliferation induced by angioetensin ⅡCAOYumeng,ZHENGShuguo,ZHAOMengqiu,RENYounan,TUPengcheng,LIFangyuan,CHENXuewei,CHANGXueyun

Clinical School,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Abstract【】Objective：To observe the effect of sesamin on the collagen secretion and proliferation of cardiac fibroblasts(CF) induced by angiotensin Ⅱ (AngⅡ)as well as the potential mechanisms.Methods:Cardiac fibroblasts were isolated from neonatal rats with trypsin and collagenase digestion and purified by differential attachment technique.MTT assay was applied to assess the effect of sesamin on the proliferation of cardiac fibroblasts after stimulation with Ang II.Hydroxyproline method was used to determine the collagen content,enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for measurement of TGF-β1 level,and colorimetric method for evaluation of the cellular total antioxidant capacity(T-AOC) and malonaldehyde (MDA)level.Results:Sesamin significantly suppressed AngⅡ induced CF proliferation and collagen secretion as well as TGF-β1 expression(P<0.05 or P<0.01),whereas boosted cellular T-AOC and led to decrease of MDA level(P<0.05 or P<0.01).Conclusion:Sesamin is capable of suppressing AngⅡ induced CF proliferation and collagen synthesis.The potential mechanisms might involve boosted antioxidant capacity and down-regulation of TGF-β1 expression.

【Key words】 sesamin;cardiac fibroblasts;angiotensin Ⅱ;oxidative stress

心肌纖維化(MF)是高血壓心肌重構(gòu)的關(guān)鍵病理特征之一，也是導(dǎo)致心臟功能衰竭的主要原因。減少膠原沉積、抑制MF，是改善高血壓性心肌重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是高血壓治療的重要目標(biāo)之一。持續(xù)高血壓可引起腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)激活，導(dǎo)致循環(huán)及心臟局部血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平升高，上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)的表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致纖維化[1]。高血壓還可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，損傷機(jī)體抗氧化系統(tǒng)，進(jìn)而促進(jìn)MF進(jìn)程[2]，抗氧化劑能減輕心梗所致的心肌重構(gòu)[3]，提示抗氧化劑可能是防治高血壓心肌重構(gòu)的有效措施之一。

芝麻素是芝麻中的主要活性成分，具有抗氧化[4]、抗高血壓[5]等多種藥理作用。本實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)報(bào)道[6]基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察芝麻素對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CF增殖及膠原分泌的影響，在細(xì)胞水平上初探芝麻素干預(yù)MF的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物新生SD大鼠，購(gòu)自于南京市江寧區(qū)青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2藥品與試劑芝麻素，上海純優(yōu)生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基，Hyclone；胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)，Gibco；Ⅱ型膠原酶，sigma；AngⅡ，阿拉丁試劑(上海)有限公司；波形蛋白(Vimentin)一抗，博奧森生物技術(shù)有限公司；α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)一抗，碧云天生物技術(shù)研究所；SABC試劑盒，DAB，武漢博士德生物工程有限公司；大鼠TGF-β1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，上海朗頓生物技術(shù)有限公司；羥脯氨酸試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.3方法

1.3.1CF分離培養(yǎng)與鑒定乳鼠用75%乙醇浸泡10 s后轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，取出心臟置于預(yù)冷D-Hanks液中。取心尖于洗去血污后剪成約1 mm×1 mm×1 mm碎塊置于酶消化液中，37 ℃消化10 min，更換消化液，消化10 min收集上清，加入培養(yǎng)基(10%FBS)洗滌，離心棄上清后加預(yù)冷培養(yǎng)基(10% FBS)吹打懸浮，置冰中備用。剩余組織塊重復(fù)上述過(guò)程，收集細(xì)胞懸液合并離心，培養(yǎng)基洗滌后接種。培養(yǎng)1.5 h后，更換新鮮培養(yǎng)液。待細(xì)胞長(zhǎng)至近融合時(shí)消化傳代，實(shí)驗(yàn)采用第2～6代細(xì)胞。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定。

1.3.2CF增殖測(cè)定按1×104/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，分為對(duì)照組、AngⅡ組及AngⅡ+芝麻素組。無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，芝麻素各組加入相應(yīng)濃度芝麻素孵育12 h。除對(duì)照組外，其余各組均加入AngⅡ孵育24 h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖水平，增殖抑制率(%)=(AngⅡ組OD值-給藥組OD值)/AngⅡ組OD值×100%。

1.3.3羥脯氨酸測(cè)定按1×105/孔的密度將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞分組同上。收集培養(yǎng)上清液，按說(shuō)明測(cè)定羥脯氨酸含量。

1.3.4TGF-β1含量測(cè)定細(xì)胞的分組及處理同1.3.3。收集上清液，按說(shuō)明書(shū)測(cè)定TGF-β1含量。

1.3.5MDA及T-AOC水平測(cè)定同1.3.3項(xiàng)下收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液后按試劑盒說(shuō)明測(cè)定MDA，PBS洗滌細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞，離心后蛋白定量并按說(shuō)明測(cè)定T-AOC。

2結(jié)果

2.1CF鑒定倒置顯微鏡下觀察，正常心肌成纖維細(xì)胞呈梭形、多角形，無(wú)搏動(dòng)，胞質(zhì)淡而透明，折光弱，中央卵圓核，胞質(zhì)向外伸出突起。免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定α-SMA表達(dá)陰性(圖1A)，Vimentin表達(dá)陽(yáng)性(圖1B)，符合CF特征。

A:α-SMA蛋白表達(dá)陰性；B:Vimentin蛋白表達(dá)陽(yáng)性

圖1CF鑒定(×100)

2.2芝麻素對(duì)CF增殖及膠原分泌的影響膠原蛋白含量采用羥脯氨酸法測(cè)定。由表1可見(jiàn)，AngⅡ能明顯促進(jìn)CF增殖及膠原分泌(P<0.01)，而芝麻素對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的增殖及膠原分泌具有顯著抑制作用(P<0.01)。

組別終濃度(mol/L)OD值抑制率(%)Hydroxyproline(μg/mL)control-0.42±0.02-32.85±2.70AngⅡ10-70.59±0.04aa-44.77±3.34aaSesamin10-40.44±0.01bb24.0933.92±1.64bbSesamin10-50.48±0.03bb21.4836.43±3.97bbSesamin10-60.53±0.069.3940.51±2.57F值-23.19-21.53

注：與Control組相比，aaP<0.01；與AngⅡ組相比，bbP<0.01

2.3芝麻素對(duì)TGF-β1蛋白表達(dá)的影響AngⅡ能明顯增加心肌成纖維細(xì)胞TGF-β1表達(dá)水平(P<0.01)，中劑量和高劑量芝麻素均可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的TGF-β1表達(dá)(P<0.01或P<0.05)。

表2芝麻素對(duì)心肌成纖維細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的影響

組別終濃度(mol/L)TGF-β1(pg/mL)control-131.91±21.30AngⅡ10-7179.82±13.97aaSesamin10-4140.32±18.65bbSesamin10-5153.12±13.48bSesamin10-6162.92±17.58F值-5.98

注：與Control組相比，aaP<0.01；與AngⅡ組相比，bP<0.05，bbP<0.01

2.4芝麻素對(duì)T-AOC和MDA水平的影響由表3可見(jiàn)，AngⅡ組CF總抗氧化能力明顯下降(P<0.01)，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量明顯升高(P<0.01)，提示AngⅡ可引起細(xì)胞氧化損傷。芝麻素中、高劑量組T-AOC水平均明顯升高(P<0.01)，MDA水平顯著降低(P<0.01)，提示芝麻素可有效提高心肌成纖維細(xì)胞抗氧化能力，減輕氧化損傷。

表3芝麻素對(duì)成纖維細(xì)胞T-AOC和MDA水平的影響

組別終濃度(mol/L)T-AOC(U/mgprot)MDA(nmol/mL)control-1.72±0.3043.91±5.35AngⅡ10-71.06±0.15aa78.00±4.68aaSesamin10-41.50±0.13bb52.44±5.20bbSesamin10-51.35±0.12bb57.91±5.86bbSesamin10-61.22±0.1164.67±15.21F值-9.8912.10

注：與Control組相比，aaP<0.01；與AngⅡ組相比，bbP<0.01

3討論

CF是心肌間質(zhì)的主要細(xì)胞成分，也是產(chǎn)生膠原的主要細(xì)胞。高血壓時(shí)，CF異常增殖并分泌大量膠原，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積，引起心肌重構(gòu)。羥脯氨酸主要存在于膠原蛋白，是其中特異的氨基酸成分，且含量相對(duì)恒定，因此通過(guò)測(cè)定其水平可以反映心肌纖維化程度[7]。本研究顯示，AngⅡ能明顯促進(jìn)CF增殖和膠原分泌，提示RAS激活是高血壓心肌重構(gòu)重要參與因素之一。給予芝麻素預(yù)孵后，細(xì)胞增殖和膠原合成被抑制，提示芝麻素減輕高血壓心肌重構(gòu)與抑制CF增殖和膠原分泌有關(guān)。

研究表明，過(guò)表達(dá)TGF-β1能導(dǎo)致心肌肥厚和心肌纖維化[8]，而在TGF-β1基因缺陷小鼠模型則未見(jiàn)明顯心肌重構(gòu)效應(yīng)[9]，提示AngⅡ誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)需TGF-β1介導(dǎo)。本研究結(jié)果顯示，芝麻素能明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的TGF-β1表達(dá)，這一結(jié)果與其抑制CF增殖和膠原合成一致，提示芝麻素可能通過(guò)抑制TGF-β1表達(dá)而抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CF增殖和膠原合成。

病理情況下，ROS產(chǎn)生過(guò)多或抗氧化體系受損時(shí)，過(guò)量ROS不能及時(shí)清除，參與多種疾病的發(fā)展進(jìn)程，如ROS能夠直接上調(diào)TGF-β1蛋白表達(dá)，刺激CF增殖，并誘導(dǎo)膠原分泌[10]。高血壓可引起體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)受損并增加ROS生成，而過(guò)度激活的RAS也可增加ROS產(chǎn)生。ROS既可直接引起組織細(xì)胞氧化損傷，又可反過(guò)來(lái)促進(jìn)AngⅡ生成，形成惡性循環(huán)，共同促進(jìn)心肌重構(gòu)進(jìn)程。本研究顯示，芝麻素可明顯增強(qiáng)CF抗氧化能力，減輕AngⅡ誘導(dǎo)的氧化損傷，提示芝麻素抑制CF增殖和膠原合成可能與增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力有關(guān)。綜上所述，芝麻素能明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，其機(jī)制可能與提高細(xì)胞抗氧化能力、抑制TGF-β1表達(dá)有關(guān)。這一結(jié)果與前期發(fā)現(xiàn)的芝麻素可抑制高血壓心肌重構(gòu)作用一致，提示芝麻素可能通過(guò)抑制CF增殖和膠原合成而減輕高血壓心肌重構(gòu)。

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