流式細(xì)胞儀與顯微鏡聯(lián)合檢測MRD的臨床價值*

李鳳1蒲澤晏1劉方久2唐雪梅3魏容1梁艷麗1王欣3馮簏潔1

(遂寧市中心醫(yī)院1.檢驗科，2.基礎(chǔ)實驗室，3.血液科， 四川 遂寧629000)

【摘要】目的了解流式細(xì)胞儀與顯微鏡聯(lián)合檢測微小殘留白血病細(xì)胞(MRD)的臨床價值。方法采集已確診的白血病患者65例經(jīng)化療完全緩解(CR)后的骨髓，同時用四色多參數(shù)流式細(xì)胞儀和奧林巴斯顯微鏡做MRD檢測共233次，檢測急性白血病患者完全緩解后治療過程中不同時間點的MRD。結(jié)果65例急性白血病患者誘導(dǎo)治療緩解達(dá)CR后的233次MRD檢測中，流式細(xì)胞儀MRD檢測陽性率為55.4%(129/233例)；顯微鏡FAB形態(tài)學(xué)方法檢測陽性率為35.63%(83/233例)。流式細(xì)胞儀MRD監(jiān)測的陽性率明顯高于顯微鏡FAB形態(tài)學(xué)檢測，兩種方法結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；233次MRD檢測中59次顯微鏡形態(tài)學(xué)檢測陰性而流式細(xì)胞儀檢測陽性，13次顯微鏡檢測陽性而流式細(xì)胞儀檢測陰性。結(jié)論用四色多參數(shù)流式細(xì)胞儀能快速有效地對急性白血病患者進行MRD檢測；用流式細(xì)胞儀與顯微鏡聯(lián)合檢測MRD，可避免因白血病細(xì)胞在治療過程中某些標(biāo)志丟失或改變而造成MRD假陰性，進一步提高MRD陽性檢出率，對于提高急性白血病患者的生存率及生存質(zhì)量和療效評估及預(yù)后監(jiān)測都具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】微小殘留白血病細(xì)胞； 急性白血病； 流式細(xì)胞術(shù)； 顯微鏡

【中圖分類號】R 446.8【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

基金項目：遂寧市科技計劃項目(09M013)

收稿日期：( 2014-08-28； 編輯： 母存培)

Clinical application evaluation of MRD monitoring with flow cytometry and microscopeLI Feng1, PU Zeyan1, LIU Fangjiu2,etal

(1.ClinicalLaboratory,CentralHospitalofSuining,Suning629000,Sichuan;

2.BasicLaboratory,CentralHospitalofSuining,Suining629000,Sichuan;

3.DepartmentofHematology,CentralHospitalofSuining,Suining629000,Sichuan)

Abstract【】ObjectiveTo find the clinical value of the minimal residual disease (MRD) with flow cytometry and microscope. MethodsWe collected marrow from the 65 patients who complete remission after chemotherapy and detected the MRD levels for 223 times in the therapy progress with four-color multiparameter flow cytometry and OLYMPUS microscope. ResultsThe positive rate of MDR detected with flow cytometry was 55.4%(129/233). The positive rate of MDR detected with microscope was 35.63%(83/233). The positive rate of MDR detected with flow cytometry was significant higher than that detected with microscope. The difference was considered statistically significant(P<0.01). 59 cases were MDR position detected with flow cytometry but negative with microscope. 13 cases were MDR negative detected with flow cytometry but positive with microscope. ConclusionWith four-color multiparameter flow cytometry, we could monitor the MDR level of patients with acute leukemia quickly and effectively. United monitoring with flow cytometry and microscope could avoid the false negative because of biomarker change and improve the detection rate of MDR. It is meaningful for improving the survival rate and quality of life of patients with acute leukemia, evaluating of curative effect and monitoring the prognosis.

【Key words】Minimal residual disease; Acute leukemia; Flow cytometry; Microscope

1材料與方法

1.1一般資料選擇我院血液科2012年1月1日~2013年12月31日住院的、經(jīng)奧林巴斯顯微鏡FAB細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色及四色流式細(xì)胞儀免疫學(xué)分型確診為急性白血病患者65例，分別為AML-M1 4例、AML-M2 13例、AML-M3 15例、AML-M4 3例、AML-M5 12例、AML-M6 2例、ALL 16例，其中男39例，女26例，年齡3~75歲，平均35歲。在急性白血病化療1個月經(jīng)FAB診斷標(biāo)準(zhǔn)完全緩解后，分別在緩解期不同維持治療期行骨髓復(fù)查時同時做流式細(xì)胞計數(shù)分析和顯微鏡FAB形態(tài)學(xué)MRD檢查，總共233次。

1.2儀器和試劑所用儀器為美國BD公司生產(chǎn)的FACSCalibur四色多參數(shù)流式細(xì)胞儀和日本奧林巴斯公司生產(chǎn)的OLYMPUS BX51高清顯微鏡；試劑單克隆抗體為BD公司生產(chǎn)的原裝配套試劑，組織化學(xué)染色試劑由上海太陽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)提供，瑞姬氏染色液由實驗室自配。

1.3檢測方法采集已確診的急性白血病患者并經(jīng)化療達(dá)完全緩解后的骨髓做MRD檢查，同時采用四色多參數(shù)流式細(xì)胞儀和奧林巴斯顯微鏡檢測，監(jiān)測急性白血病患者完全緩解后的治療過程中不同時間點的微小殘留白血病細(xì)胞。首先采集約0.2ml骨髓用于直接涂片染色做顯微鏡FAB形態(tài)學(xué)檢測，并分類計數(shù)原始細(xì)胞的比率。接著采集約1~2ml骨髓置于含肝素的真空采血管內(nèi)顛倒混勻，用于做流式細(xì)胞計數(shù)及單克隆抗體檢查，分析有無細(xì)胞表型異常及原始細(xì)胞比率增高。操作按儀器使用說明書規(guī)范化操作，并嚴(yán)格執(zhí)行SOP文件。

1.4判定標(biāo)準(zhǔn)用四色多參數(shù)流式細(xì)胞分析儀做熒光標(biāo)記檢測分析，在細(xì)胞篩選時白血病細(xì)胞出現(xiàn)的區(qū)域內(nèi)有細(xì)胞存在，即判斷為MRD陽性。以這類細(xì)胞占骨髓單個細(xì)胞總數(shù)的比率作為MRD的測定值。流式細(xì)胞儀檢測MRD<0.01%為陰性，≥0.01%或表型異常為陽性。顯微鏡FAB形態(tài)學(xué)檢查標(biāo)準(zhǔn)：參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》判斷[6]。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

對233次流式細(xì)胞儀與顯微鏡同時檢測MRD的結(jié)果見表1。表1顯示，流式細(xì)胞儀檢測MRD的陽性率明顯高于顯微鏡FAB形態(tài)學(xué)檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。本研究發(fā)現(xiàn)，233次MRD檢測中59次顯微鏡FAB形態(tài)學(xué)檢測陰性，而四色多參數(shù)流式細(xì)胞儀檢測陽性；13次顯微鏡FAB形態(tài)學(xué)檢測陽性而四色多參數(shù)流式細(xì)胞儀檢測陰性。提示二者聯(lián)合檢測，可進一步提高微小殘留白血病細(xì)胞陽性檢出率。

表1流式細(xì)胞儀與顯微鏡檢測MRD結(jié)果比較

Table 1The comparison of MRD detected by flow cytometry and microscope

組別次數(shù)MRD檢出次數(shù)(×10-2)流式細(xì)胞儀233129(55.4)顯微鏡23383(35.6)χ218.312P<0.01

3討論

流式細(xì)胞儀的檢測原理就是對細(xì)胞及其他生物顆粒進行多參數(shù)分析，是一種可對特定的細(xì)胞群加以分選的細(xì)胞定量分析新技術(shù)；是單克隆抗體技術(shù)、激光技術(shù)、及電子計算機技術(shù)的綜合應(yīng)用。其特點就是可以在幾秒鐘內(nèi)分析數(shù)萬個細(xì)胞，快速準(zhǔn)確地對每個細(xì)胞進行多參數(shù)定量分析，四色多參數(shù)流式細(xì)胞儀還可以識別1個細(xì)胞上同時存在多種抗原。MRD的流式細(xì)胞儀檢測就是根據(jù)急性白血病患者初診時白血病細(xì)胞免疫分型表型特征，分別采用不同的單克隆抗體組合，檢測經(jīng)誘導(dǎo)化療完全緩解后的骨髓MRD水平變化[7]。本研究提示應(yīng)用四色多參數(shù)流式細(xì)胞儀可以發(fā)現(xiàn)急性白血病完全緩解后顯微鏡FAB形態(tài)學(xué)檢測不到的白血病細(xì)胞，尤其是AML-M5和ALL型微小殘留白血病細(xì)胞。流式細(xì)胞儀的優(yōu)勢就是可以在很短時間內(nèi)分選大量特定的細(xì)胞群，檢測表型異常的白血病細(xì)胞，也就是從白血病細(xì)胞表型異常進行診斷，從而將急性白血病的緩解標(biāo)準(zhǔn)從細(xì)胞學(xué)水平提高到了免疫學(xué)水平。因此，應(yīng)用四色多參數(shù)流式細(xì)胞儀檢測方法發(fā)現(xiàn)這種潛在的白血病細(xì)胞，并且進行定量分析檢測，有助于臨床急性白血病患者的早期診斷和早期治療，從而提高患者的生存率及生存質(zhì)量。

流式細(xì)胞儀的檢測雖然速度更快，更經(jīng)濟適用，但在部分患者中由于缺乏表面膜抗原標(biāo)記而使其應(yīng)用受到限制，因此流式細(xì)胞儀也有它的局限性[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，顯微鏡FAB形態(tài)學(xué)檢測83次陽性者中，四色多參數(shù)流式細(xì)胞儀檢測為陰性者13次(15.66%)，其原因，可能為患者缺乏表面膜抗原標(biāo)記或骨髓標(biāo)本采集量過大而被稀釋所致。由此可見，流式細(xì)胞儀與顯微鏡聯(lián)合監(jiān)測MRD可取長補短，進一步提高微小殘留白血病細(xì)胞陽性檢出率；避免因白血病細(xì)胞在治療過程中某些標(biāo)志丟失或改變而造成MRD假陰性[9-11]。對于MRD檢測陽性的急性白血病患者必須密切監(jiān)測MRD的變化，采用連續(xù)定期監(jiān)測和動態(tài)觀察的方式，以保證急性白血病患者及時治療并清除MRD，對降低急性白血病的復(fù)發(fā)率、達(dá)到個體化治療及治愈的目的具有十分重要的臨床意義[12]。

（1）克里氏艾美耳球蟲。卵囊呈典型的卵圓形，平均為40μm×21μm，形狀指數(shù)為1.904。卵囊囊壁外層光滑、色澤淡黃，內(nèi)層為褐黃色，有卵膜孔，有極帽，孢子囊為寬卵圓形，有內(nèi)殘體，斯氏體不明顯或無，沒有外殘體，有1個或多個極粒，孢子化時間約60 h。

4結(jié)論

用四色多參數(shù)流式細(xì)胞儀檢測MRD，能快速有效地對急性白血病患者進行MRD檢測；但是用流式細(xì)胞儀與顯微鏡聯(lián)合檢測MRD，可避免因白血病患者由于表面膜抗原標(biāo)記缺乏或白血病細(xì)胞在治療過程中某些標(biāo)志丟失或改變，或骨髓標(biāo)本采集時過度稀釋等造成MRD假陰性，進一步提高MRD陽性檢出率，對提高急性白血病患者的生存率及生存質(zhì)量和療效評估及預(yù)后監(jiān)測都具有重要意義。

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