人β防御素4對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖凋亡及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響*

曹玉紅1張靜怡2張光運(yùn)3曹艷華4

(1. 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科，陜西 西安 710032; 2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一醫(yī)院，陜西 西安 710061；

3.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710032;4.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院兒科，山東 濟(jì)南250031)

【摘要】目的觀察人β防御素4(HBD4)對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)細(xì)胞的殺傷作用,探討HBD4對(duì)NB細(xì)胞增殖、凋亡及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。方法將HBD4作用于NB細(xì)胞，根據(jù)HBD4終濃度將NB細(xì)胞分為A、B、C 3組，濃度分別為5、10、20 mg·L-1；HBD4作用時(shí)間分別為12、24、48h。噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定HBD4對(duì)NB細(xì)胞增殖的抑制作用，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HBD4作用于NB細(xì)胞后細(xì)胞凋亡情況；分光光度法檢測(cè)HBD4對(duì)NB細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果MTT檢測(cè)結(jié)果:NB細(xì)胞抑制率均隨HBD4濃度的升高而升高(P<0.01),隨HBD4作用時(shí)間的延長而升高(P<0.01)，提示HBD4對(duì)NB細(xì)胞的抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：A、B、C三組NB細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組(P<0.01)。三組NB細(xì)胞凋亡率比較亦有顯著差異(P<0.01)，說明隨藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率呈增高趨勢(shì)； 分光光度法檢測(cè)結(jié)果顯示：A、B、C三組NB細(xì)胞Caspase-3含量均高于對(duì)照組(P<0.01)。三組NB細(xì)胞Caspase-3含量比較亦有顯著差異(P<0.01)，說明隨藥物濃度的增加，細(xì)胞Caspase-3含量呈增高趨勢(shì)。結(jié)論HBD4對(duì)NB細(xì)胞增殖具有抑制作用；HBD4可誘導(dǎo)NB細(xì)胞凋亡;HBD4可能是通過激活Caspase-3誘導(dǎo)NB細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】人β防御素4； 神經(jīng)母細(xì)胞瘤； Caspase-3； 細(xì)胞凋亡

【中圖分類號(hào)】R 329.2+8【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

基金項(xiàng)目:陜西省自然科學(xué)基金(2012JM4054); 陜西省科技攻關(guān)計(jì)劃(2009K12-01)

通訊作者：張光運(yùn),E-mail: zhgyun@fmmu.edu.cn

收稿日期：( 2014-07-01； 編輯： 張文秀)

Influence of human β-defensin 4 on the proliferation, apoptosis and Caspase-3 protein expression of neuroblastoma cellsCAO Yuhong1, ZHANG Jinyi2, ZHANG Guangyun3,etal

(1.DepartmentofPediatrics,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China;

2.TheFirstAffiliatedHospitalMedicineCollegeofXi'anJiaoTongUniversity,Xi'an710061,China;

3.DepartmentofNeurology,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China;

4.DepartmentofPediatrics，GeneralHospitalofJinanMilitaryDistrict，Jinan250031，China)

Abstract【】ObjectiveTo examine cytotoxicity of human β defensin 4(HBD4)on neuroblastoma (NB) cell and explore the influence of human β-defensin 4 on proliferation, apoptosis and Caspase-3 protein expression of NB cells. MethodsIn this research, NB cells were treated with HBD4. According to final concentration of HBD4, NB cells were divided into 3 groups: A, B and C with the corresponding concentrations of 5, 10, and 20 mg.L-1, respectively. The reaction times were 12, 24 and 48h respectively. Methyhhiazolyldiphenyl- tetrazoliumbromide(MTT)assay was adopted to detect the inhibitory effect of HBD4 on NB cell proliferation. In addition, NB Cell apoptosis was assessed by flow cytometry and Caspase-3 activity was detected by spectrophotometry. ResultsMTT assay showed the inhibitory rate of NB cells treated with HBD4 increased with the increase of HBD4 concentration and the prolongation of acting time of HBD4(P<0.01), which indicated that HBD4 inhibited the proliferation of NB cells in a time and dose dependent manner. Flow cytometry assay showed that NB cell Apoptosis rates of group A, B and C were all higher than that of the control group(P<0.01), and there were statistically significant differences among the three groups(P<0.01), which suggested that the apoptosis rate increased with the increase of HBD4 concentration. In the third place, Spectrophotometry assay showed that Caspase-3 activity of group A, B and C were all higher than that of the control group(P<0.01), and the differences among the three groups were statistically significant(P<0.01), which suggested that the Caspase-3 activity increased with the increase of HBD4 concentration. ConclusionHBD4 inhibits the proliferation of NB cells by means of inducing cellular apoptosis via increasing Caspase-3 activity.

【Key words】Human β defensin 4; Neuroblastoma; Caspase-3; Apoptosis

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)是兒童一種常見的惡性實(shí)體腫瘤，大部分患兒在就診時(shí)已廣泛轉(zhuǎn)移，病死率極高。傳統(tǒng)的放療或化療毒副作用大，對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞均有不同程度的殺傷作用，不可避免地造成多臟器損害。另外腫瘤細(xì)胞對(duì)多種抗癌藥物產(chǎn)生抗藥性，是腫瘤化療失敗的主要原因之一[1-4]。因此研究開發(fā)新一代毒副作用小、又能克服耐藥性的抗腫瘤藥物成為目前腫瘤防治研究的焦點(diǎn)。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，一些具有廣譜殺菌活性的防御素，可以特異性殺傷某些腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長和增殖，但對(duì)正常人體細(xì)胞不造成破壞[5-12]。人β防御素4(HBD4)是2001年Jose-Ramon發(fā)現(xiàn)的一種新型β防御素。研究表明，HBD4對(duì)多種細(xì)菌具有殺傷作用，HBD4對(duì)人體各個(gè)系統(tǒng)的先天免疫尤其是粘膜和上皮的防御起非常重要的作用[13]。HBD4的抗腫瘤作用及其相關(guān)機(jī)制研究國內(nèi)罕見報(bào)道。我們將HBD4作用于體外培養(yǎng)的NB細(xì)胞，觀察HBD4對(duì)NB細(xì)胞增殖及凋亡作用的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料重組人β防御素4購自上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司。細(xì)胞系：患兒，女，4歲，經(jīng)病理證實(shí)為NB，Evans分期Ⅳ期，并全身骨髓轉(zhuǎn)移，術(shù)中取新鮮腫瘤標(biāo)本，體外細(xì)胞培養(yǎng)，制備細(xì)胞系，已傳至45代。Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。常規(guī)生化試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測(cè)HBD4對(duì)NB細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長期NB細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液,以1×104個(gè)/孔，接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入不同濃度HBD4,加DMEM培養(yǎng)液至200μL。實(shí)驗(yàn)組根據(jù)HBD4終濃度將NB細(xì)胞分為A、B、C 3組，濃度分別為5、10、20mg·L-1。對(duì)照組只加DMEM培養(yǎng)液。HBD4作用時(shí)間分別為12、24、48h，每一濃度對(duì)應(yīng)的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均做4個(gè)復(fù)孔，置37℃、50mL·L-1二氧化碳(CO2)孵箱中培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)到相應(yīng)時(shí)間后，每孔加入MTT溶液[2g·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)]50μL，37℃孵育4h，棄上清，每孔加入二甲亞砜150μL，振蕩10min，測(cè)每孔A490nm值，根據(jù)公式：抑制率=(對(duì)照組A490nm-觀察組A490nm)/對(duì)照孔A490nm，計(jì)算抑制率。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)HBD4對(duì)NB細(xì)胞凋亡的影響接種對(duì)數(shù)生長期NB細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板，1×105個(gè)/孔，每孔2mL。實(shí)驗(yàn)組加入HBD4，使HBD4終濃度達(dá)到上述A、B、C 3個(gè)濃度，對(duì)照組設(shè)置同前，放人CO2孵箱中培養(yǎng)24h，胰酶消化，將細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移至圓底離心管內(nèi)，PBS洗滌，加入2mL預(yù)冷的70%酒精，4℃固定30min，PBS洗滌，加入核糖核酸酶A于5001μL 1×PBS中，37℃孵育30min，PBS洗滌，加入碘化丙啶于500μL 1×PBS中，室溫避光孵育30min，混勻，過300目篩網(wǎng)，置流式管中，進(jìn)行細(xì)胞凋亡情況測(cè)定。

1.2.3分光光度法檢測(cè)HBD4對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)的影響取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106個(gè)/mL，接種于48孔培養(yǎng)板，每孔250μL。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組設(shè)置同1.2.2，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，600g 4℃離心5min收集細(xì)胞，小心吸除上清，同時(shí)確保盡量沒有細(xì)胞被吸除，PBS洗滌一次。同前吸除上清后，加入50μL裂解液，重懸細(xì)胞，冰浴裂解15 min。之后4℃ 16000g離心10min，上清轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管中。按照Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說明書操作,加入AC-DEVD-pNA 10μL，上酶標(biāo)儀405nm處檢測(cè)caspase-3活性。

2結(jié)果

2.1HBD4對(duì)NB細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：不同濃度HBD4作用于NB細(xì)胞相同時(shí)間，抑制率均隨濃度升高而升高(P<0.01)；相同濃度HBD4分別作用于NB細(xì)胞12，24，48h，抑制率隨時(shí)間延長而升高(P<0.01)，提示HBD4對(duì)NB細(xì)胞的殺傷作用具有時(shí)間和劑量依賴性,見表1。

表1　不同濃度HBD4對(duì)NB細(xì)胞的抑制率比較

2.2HBD4對(duì)NB細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：A、B、C三組NB細(xì)胞凋亡率分別為(12.275±0.685) %、(18.300±0.356)%、(26.150±0.656)%，對(duì)照組凋亡率為(1.575±0.299)%，三組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組(P<0.01)。三組NB細(xì)胞凋亡率比較亦有顯著差異(P<0.01)，說明隨藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡率呈增高趨勢(shì)(表2)。

2.3HBD4對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)的影響A、B、C三組NB細(xì)胞Caspase-3 A值分別為0.155±0.013、0.245±0.013、0.328±0.010，對(duì)照組Caspase-3 A值為0.078±0.006，三組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組(P<0.01)。三組NB細(xì)胞Caspase-3含量比較亦有顯著差異(P<0.01)，說明隨藥物濃度的增加，細(xì)胞Caspase-3含量呈增高趨勢(shì)(表2)。

表2HBD4對(duì)NB細(xì)胞凋亡率及Caspase-3表達(dá)的影響

Table 2Influence of HBD4 on NB cell apoptosis and expression of caspase-3

組別細(xì)胞凋亡率(×10-2)caspase-3(A值)對(duì)照組1.575±0.2990.078±0.006A組12.275±0.6850.155±0.013B組18.300±0.3560.245±0.013C組26.150±0.6560.328±0.010F1540.909403.500P0.0000.000

3討論

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),防御素對(duì)白血病、淋巴瘤及多種實(shí)體瘤細(xì)胞如：肝癌、腎癌、前列腺癌、膀胱癌細(xì)胞等具有殺傷作用[5-13]。防御素對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性大于非腫瘤細(xì)胞, 因此在相同劑量下, 防御素只能殺死腫瘤細(xì)胞, 對(duì)正常細(xì)胞無殺傷作用；體內(nèi)防御素水平可能成為判斷某些腫瘤發(fā)生、療效及預(yù)后的生物指標(biāo)。目前關(guān)于HBD4對(duì)NB細(xì)胞的殺傷作用及機(jī)制的研究國內(nèi)外鮮見報(bào)道。本研究采用HBD4為研究藥物，觀察HBD4對(duì)NB細(xì)胞生長的影響，結(jié)果表明：HBD4對(duì)NB細(xì)胞有殺傷作用，并且其殺傷作用具有時(shí)間和劑量依賴性。這為NB患兒提供了一種新的治療方法。

盡管對(duì)防御素細(xì)胞毒作用的確切機(jī)制還不十分清楚, 但目前研究發(fā)現(xiàn),防御素的抗腫瘤作用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：①對(duì)細(xì)胞膜的攻擊作用:腫瘤細(xì)胞表面較正常細(xì)胞帶有較多的負(fù)電荷, 通過靜電作用吸引大量含正電荷的防御素黏附于腫瘤細(xì)胞表面, 使腫瘤細(xì)胞膜的正常屏障破壞。細(xì)胞膜上的電壓依賴性離子通道形成, 導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加, 胞內(nèi)物質(zhì)泄漏, 導(dǎo)致細(xì)胞死亡。②對(duì)腫瘤細(xì)胞骨架的斷裂作用。③對(duì)線粒體的損傷作用。④對(duì)染色體的破壞作用。⑤誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等[14]。

凋亡途徑包括外在(細(xì)胞質(zhì)) 和內(nèi)在(線粒體)途徑。外在途徑是通過腫瘤壞死因子受體超家族成員的Fas死亡受體觸發(fā)引起; 內(nèi)在途徑是刺激引起細(xì)胞色素C從線粒體釋放并激活死亡信號(hào)，而Caspase蛋白酶家族，在這個(gè)過程中起了重要作用，其中尤以Caspase-3被認(rèn)為與真核細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛研究和關(guān)注。其機(jī)制主要是參與了凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和使DNA修復(fù)分子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、骨架蛋白等關(guān)鍵蛋白的失活等，而達(dá)到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[15]。已證明，高濃度的人中性粒細(xì)胞防御素1(HNP1)在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用,可直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。由HNP1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡涉及這兩種途徑: 一方面, HNP1能促進(jìn)淋巴細(xì)胞釋放出TNFA, 通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡; 另一方面, HNP1還可通過線粒體途徑介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。人β防御素1能抑制前列腺癌DU145 和PC3細(xì)胞生長,引起腫瘤細(xì)胞的快速溶解以及半胱天冬酶介導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞凋亡[9]。

4結(jié)論

HBD4對(duì)NB細(xì)胞增殖具有抑制作用;HBD4可誘導(dǎo)NB細(xì)胞凋亡,而且HBD4可能是通過激活Caspase-3誘導(dǎo)NB細(xì)胞凋亡。

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