原兒茶酸對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用

覃華1，張琰1，杜小燕1，崔穎2，王茹1*

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥劑科，西安 710038； 2.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院輸血科，西安 710038)

摘要：目的研究原兒茶酸對大鼠心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷的保護作用。方法采用結(jié)扎SD大鼠冠狀動脈建立MI/R (30 min/3 h)損傷模型，將動物隨機分為假手術(shù)組、模型組、原兒茶酸組(低、中、高劑量)、丹參多酚酸鹽6組。除模型組于再灌注時給予生理鹽水外，原兒茶酸低、中、高劑量組及丹參多酚酸鹽組于再灌注即刻給予原兒茶酸(5，10和20 mg·kg-1)及丹參多酚酸鹽(20 mg·kg-1)。實驗過程中監(jiān)測心功能，實驗?zāi)y定心肌梗死面積，并檢測血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白(cTnI)水平。結(jié)果與模型組相比，原兒茶酸中、高劑量組大鼠心功能得以改善(P<0.05)，心肌梗死面積顯著減少(P<0.05)，血清中心肌損傷酶CK-MB、cTnI的水平顯著下降(P<0.05)。結(jié)論原兒茶酸對大鼠MI/R損傷具有一定的保護作用。

關(guān)鍵詞：原兒茶酸；心肌缺血/再灌注；心功能；心肌梗死

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.016

中圖分類號：R965文獻標志碼：A

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)

作者簡介：覃華，女，主管藥師

收稿日期：(2015-03-02)

Protective effect of protocatechuic acid on myocardial ischemia/reperfusion injury in rats

QIN Hua1，ZHANG Yan1，DU Xiaoyan1，CUI Ying2，WANG Ru1*(1.Department of Pharmacy，Tangdu Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710038，China；2.Department of Blood Transfusion, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710038，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the protection effect of protocatechuic acid on myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) injury in rats. Methods The rats were subjected to MI/R (30 min/3 h) by occluding the left anterior descending artery. The rats randomly received one of the following treatments intravenously and were randomly divided into six groups: sham group，model group，protocatechuic acid group (low，middle and high doses) and salvianolate group. Sham-operated control rats (sham) underwent the same surgical procedures with the exception of left anterior descending coronary artery occlusion. Protocatechuic acid and salvianolate groups were treated with the dose of 5，10 and 20 mg·kg-1 of protocatechuic acid and 20 mg·kg-1 of salvianolate， respectively. The change of cardiac function was monitored by multi-channel physiology recorder. The area of myocardial infarction and the levels of CK-MB，cTnI in serum were determined to evaluate the protection effect of protocatechuic acid. Results Compared with the model group，the cardiac function of MI/R rats was improved(P<0.05)，the infarct area and the levels of creatine kinase-MB (CK-MB) and cardiac troponin (cTnI) in the middle and high dose of protocatechuic acid groups were significantly decreased (P<0.05).ConclusionProtocatechuic acid has excellent cardioprotective effects against MI/R injury in rats.

Key words: protocatechuic acid；myocardial ischemia/reperfusion；cardiac function； myocardial infarction

*通信作者：王茹，女，副主任藥師

冠狀動脈性心臟病(coronary artery heart disease，CAHD，簡稱冠心病)對生命和健康的威脅很大，是當今造成人類死亡的頭號殺手。臨床上冠脈支架、溶栓及搭橋血管重建術(shù)等已成為傳統(tǒng)的治療方法，但在心臟血運重建過程中反而出現(xiàn)比心肌缺血更明顯、更嚴重的損傷和功能障礙，稱為再灌注損傷。目前，關(guān)于心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷領(lǐng)域的研究已經(jīng)受到醫(yī)藥學(xué)家的高度關(guān)注，探討如何減輕MI/R損傷是研究的熱點[1-2]。中藥治療MI/R損傷療效確切、前景良好[3]，其中丹參(Salviamiltiorrhizae)心肌保護作用的研究最為引人關(guān)注。丹參早已被廣泛應(yīng)用于治療冠心病、腦卒中、動脈粥樣硬化等[4-6]。早在90年代，W. Zhou等的研究表明：丹參水溶性成分在大鼠離體心臟上具有防治MI/R損傷的保護作用[7]。同時，游勇基等通過高效液相色譜法，測定丹參中4種主要的水溶性成分：丹酚酸B(salvianolic acid B)、丹參素(danshensu)、原兒茶醛(protocatechuic aldehyde)、原兒茶酸(protocatechuic acid)[8]，但迄今為止原兒茶酸防治MI/R損傷的研究卻鮮有報道。本實驗擬通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈模擬MI/R損傷模型，探究原兒茶酸是否具有抗MI/R損傷的作用。

1儀器與試藥

1.1儀器RM-4200多道生理記錄和分析處理系統(tǒng),由成都儀器廠提供。

1.2試劑原兒茶酸(protocatechuic acid)由南京替斯艾么中藥研究所提供；注射用丹參多酚酸鹽(Salvia miltiorrhiza polyphenols acid salt，SMPAS)由上海綠谷制藥有限公司提供；肌酸激酶同工酶(CK-MB)，肌鈣蛋白(cTnI)由上海西唐生物科技有限公司提供；2，3，5-氯化三苯基四氮唑藍(TTC)染色劑由中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司提供；伊文思藍(EB)由美國Sigma-Aldrich公司提供。

1.3動物SD雄性大鼠48只，清潔級，鼠齡3個月，質(zhì)量250～300 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。動物合格證號：SCXK-(軍)2007-007。

2方法

2.1MI/R模型使用30 g·L-1的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉SD大鼠后，接RM-4200多道生理記錄監(jiān)測心電變化。氣管插管之后，接小動物呼吸機。分離氣管后經(jīng)右頸總動脈插管至左心室，記錄左室壓及其微分。于左側(cè)第3～4肋骨間打開胸腔，暴漏心臟后，在左冠狀動脈前降支起始2 mm處進針，待呼吸、血壓平穩(wěn)后用5～0號無損傷縫合線穿過心肌層結(jié)扎，結(jié)扎線遠端心肌顏色發(fā)紺。缺血60 min后解除結(jié)扎再灌注3 h。以心電圖ST段抬高為結(jié)扎成功[9]。

2.2實驗分組隨機將實驗SD大鼠分為6組，分別是假手術(shù)組、模型組和原兒茶酸組及陽性對照丹參多酚酸鹽組。在原兒茶酸組中分為3個劑量組，分別是5，10和20 mg·kg-1，假手術(shù)組只進行穿線不結(jié)扎；模型組于頸靜脈給予生理鹽水；原兒茶酸組及丹參多酚酸鹽組于頸靜脈給予原兒茶酸和丹參多酚酸鹽。給藥時間均為再灌注之前給藥。

2.3測定指標

2.3.1心臟功能監(jiān)測通過多導(dǎo)生理記錄儀(RM-4200)持續(xù)監(jiān)測大鼠左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、收縮壓最大上升速率(+dp/dtmax)、舒張壓最大下降速率(-dp/dtmax)、心率(HR)等心功能指標。

2.3.2心肌梗死面積測定實驗結(jié)束后頸靜脈注射伊文思藍EB(5 mg·kg-1)2 mL，30 min后打開胸腔，取出心臟，生理鹽水充分洗凈殘血，濾紙吸干，剪去血管、結(jié)締組織、心房和右心室，留下左心室。將左心室置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min，平行房室溝將其切成5～8 片，每片厚1～2 mm。切片置于10 g·L-12，3，5-氯化三苯基四氮唑藍(TTC)中,37 ℃孵育15 min，隨后用多聚甲醛固定，正常心肌組織染成藍色，缺血心肌組織染成紅色，梗死心肌組織為白色。將切片展開平鋪于載玻片上，采用數(shù)碼相機拍攝，導(dǎo)出的照片利用圖像分析軟件Image ProPlus計算梗死面積[10]。

2.3.3血清生化指標測定實驗結(jié)束后，從SD大鼠頸動脈取血，室溫靜置20 min，3 500 r·min-1離心12 min,取血清，按照試劑盒說明書嚴格操作檢測CK-MB和cTnI水平。

3結(jié)果

3.1大鼠心功能的變化再灌注60和120 min大鼠LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax及HR的變化如表1所示。研究發(fā)現(xiàn)在灌注時不同時間點的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax及HR均降低(P<0.05)。原兒茶酸組20 mg·kg-1及丹參多酚酸鹽組，以上參數(shù)較模型組均升高(P<0.05)。詳細結(jié)果見表1。

表1原兒茶酸對MI/R損傷大鼠心功能的影響

Tab.1Effect of protocatechuic acid on cardiac function against MI/R injury in rats

± s, n=8)

注：與假手術(shù)組比較#P< 0.05；與模型組比較*P< 0.05。

3.2大鼠心肌梗死面積的變化伊文思藍及TTC染色的心臟切片見圖1。與模型組比較，原兒茶酸組的大鼠心肌梗死面積減少(P<0.05)。尤其是20 mg·kg-1組，梗死面積顯著下降，但與丹參多酚酸鹽組之間無顯著性差異(P>0.05)，詳細結(jié)果見表2。

圖1TTC染色后心肌組織的典型圖片

A.假手術(shù)組；B.模型組；C.原兒茶酸 (5 mg·kg-1)組；D.原兒茶酸(10 mg·kg-1)組；E.原兒茶酸(20 mg·kg-1)組；F.丹參多酚酸鹽組

Fig.1 Representative photographs of heart tissues taken from rats after TTC staining

A.sham operation group；B.model group;C.the model group of protocatechuic acid group(5 mg·kg-1);D.the model group of protocatechuic acid group(10 mg·kg-1);E.the model group of protocatechuic acid group(20 mg·kg-1);F.Salviamiltiorrhizagroup

表2原兒茶酸對MI/R損傷大鼠心肌梗死面積的影響

Tab.2Effect of protocatechuic acid on myocardial infarct area against MI/R injury in rats

± s, n=8)

注：與假手術(shù)組比較#P<0.05；與模型組比較*P< 0.05。

3.3大鼠血清中CK-MB和cTnI水平的變化血清中心肌酶CK-MB和cTnI的水平見表3。與假手術(shù)組相比，模型組血清中CK-MB和cTnI的水平顯著升高(P<0.05)，與模型組比較，原兒茶酸組以上心肌酶水平降低。尤其是10和20 mg·kg-1劑量組，CK-MB和cTnI水平下降顯著(P<0.05)。

表3原兒茶酸對MI/R損傷大鼠血清中CK-MB，cTnI水平的影響

Tab.3 Effect of protocatechuic acid on the levels of CK-MB，cTnI in serum against MI/R injury in rats

± s, n=8)

注：與假手術(shù)組比較#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

4討論

近年來，中醫(yī)藥對MI/R損傷的治療作用日趨重視，其中丹參的治療效果最引人關(guān)注[7]。其化學(xué)成分主要為水溶性成分和脂溶性成分兩部分。眾所周知，傳統(tǒng)中藥在使用時多用其水煎成分，因而近年來關(guān)于丹參水溶性成分的研究較多[11]。有報道認為丹參素作為丹參的主要水溶性成分，在SI/R(simulated ischemia/reperfusion)損傷的H9c2心肌細胞上，通過激活PI3K/Akt、ERK1/2信號通路發(fā)揮抗心肌細胞凋亡的作用[12]。另一種水溶性成分丹酚酸A被報道在體內(nèi)外實驗中均具有防治MI/R損傷的保護作用[13]。然而，作為丹參中主要的水溶性成分之一的原兒茶酸關(guān)于防治MI/R損傷的作用卻尚未報道。

現(xiàn)代研究表明，氧化應(yīng)激、鈣超載、白細胞激活以及能量代謝障礙等是引起MI/R損傷的主要因素，其中導(dǎo)致?lián)p傷最嚴重、時程最長的因素為氧化應(yīng)激[14]。原兒茶酸的相對分子質(zhì)量僅154 g/mol，為小分子化合物。化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有一對鄰二酚羥基，具有氧自由基清除作用。

本研究通過檢測心功能、心肌梗死面積及心肌損傷酶等指標來評價原兒茶酸在大鼠MI/R模型上的治療作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，心功能的變化與心肌MI/R損傷的程度密切相關(guān)，心臟的工作性能主要取決于心室肌的收縮和舒張性能[15]。本研究結(jié)果顯示，MI/R后大鼠LVEDP明顯升高，LVSP、+dp/dtmax明顯降低，即心臟發(fā)生靜脈張力升高，張力降低，心肌收縮功能下降。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸可不同程度地改善MI/R損傷引起的心臟舒縮功能障礙。心肌梗死面積與心功能密切相關(guān)，在臨床上對預(yù)后和評價治療效果都具有重要意義。梗死面積的衡量也被認為是評價MI/R損傷的標準之一[16]。本研究通過TTC染色后測定大鼠心肌梗死面積，發(fā)現(xiàn)原兒茶酸可以減少MI/R損傷的心肌梗死面積。同時，在心肌MI/R損傷時能引起受損心肌細胞心肌酶的釋放。臨床上特異性的心肌酶也被認為是MI/R損傷診斷的重要指標。其中cTnI和CK-MB通常被認為是急性心肌損傷的標志物[17]。通過檢測以上心肌酶。我們發(fā)現(xiàn)MI/R損傷大鼠血清中的cTnI和CK-MB的水平升高，而原兒茶酸能夠降低血清中以上2種心肌酶的水平。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)原兒茶酸能夠改善MI/R損傷時的心功能，減小心肌梗死面積，同時降低血清中標志性的心肌酶cTnI和CK-MB的釋放，效果不劣于陽性對照藥丹參多酚酸鹽，證實原兒茶酸具有防治MI/R損傷的作用，但具體的分子機制還有待進一步研究。

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