木蝴蝶總黃酮的提取及體外清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究

劉可心，蘭永強，楊娜，陳子燕，張衛(wèi)

(西北民族大學化工學院， 蘭州730124)

摘要：目的 優(yōu)化木蝴蝶中總黃酮的提取工藝，研究木蝴蝶總黃酮、水提液、精油，清除亞硝酸鹽的效果及阻斷亞硝胺合成的能力。方法 在單因素實驗的基礎上，以超聲時間、料液比和乙醇體積分數(shù)為自變量，以總黃酮提取率為因變量，對自變量各水平進行多元線性回歸和二項式擬合，通過響應面曲線法選擇較佳工藝；利用紫外分光光度法檢測研究木蝴蝶總黃酮、水提液、精油對清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的影響。結果 木蝴蝶總黃酮的較佳提取條件為：料液比1∶53，超聲時間119 min，乙醇體積分數(shù)45%，木蝴蝶中總黃酮、精油及水提物對亞硝酸鈉的最大清除率分別為65.3%，71.2%和42.2%，對亞硝胺合成的最大阻斷率分別為58.5%，36.7%和30.9%。結論 木蝴蝶總黃酮對亞硝酸鹽的最大清除率略低于精油，但高于大蒜，達到65.3%。同時抑制亞硝化反應的效果高達58.5%，高于精油，其阻斷率接近大蒜，清除率和阻斷率都高于水提液。木蝴蝶中總黃酮具有較好的清除能力和阻斷效果。

關鍵詞：木蝴蝶；總黃酮；響應面分析法；清除率；阻斷率

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.004

中圖分類號：R284文獻標志碼：A

基金項目：西北民族大學國家級大學生創(chuàng)業(yè)訓練項目資助(編號：201410742003)

收稿日期：(2015-05-11)

Extraction of total flavonoids fromOroxylumindicum(L.) Vent and theinvitrostudy on its abilities of scavenging nitrite and the synthetic blocking effect of nitrosamine

LIU Kexin，LAN Yongqiang，YANG Na，CHEN Ziyan，ZHANG Wei(School of Chemical Engineering Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730124 ，China)

Abstract:Objective To optimize the extraction process of total flavonoids in Oroxylum indicum，and to study the effect of total flavonoids from Oroxylum indicum on the nitrite savenging and synthesis blocking of nitrosamine. Methods On the basis of single factor，the response surface method was used. UV spectrophotometry was used to study the effect of the water extract and essential oil on the nitrite scavenging and nitrosamine synthesis blocking. Results The optimal extraction conditions of total flavonoids from Oroxylum indicum were as follows: the ratio of material to liquid 1∶53，ultrasonic time 119 min，ethanol concentration 45%. The maximum scavenging rate of sodium nitrite were 65.3%，71.2% and 42.2% respectively，the maximum blocking synthesis of nitrosamine was 58.5%，36.7% and 30.9% respectively. Conclusion The effect of flavonoids on nitrite scavenging was slightly lower than that of essential oil，but higher than that of garlic，reaching up to 65.3%. At the same time，the effect of inhibition of nitrosation was up to 58.5%，higher than that of oil.The blocking rate closed to the garlic.The clearance rate and blocking rate was higher than the water extract. The flavonoids have good effect on scavenging and blocking.

Key words:Oroxylumindicum；general flavone；response surface analysis；clearance rate；blocking rate

木蝴蝶為紫葳科植物木蝴蝶Oroxylumindicum(L.) Vent的干燥成熟種子，原名千張紙。木蝴蝶性味苦、甘、涼，入肺、肝、胃經，有清肺、利咽、止咳、舒肝、和胃之功效[1-2]。具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗氧化、抑制病毒及腫瘤生長等多種藥理作用。木蝴蝶中含有黃芩苷、白楊素、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、木蝴蝶定、千層紙苷等多種黃酮類物質[3-4]。目前，國內外對木蝴蝶體外消解亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究未見文獻報道。

響應面分析(RSA)法系采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計的工具，將多因子實驗中因子與指標的相互關系用多項式近似，依次可對函數(shù)的響應面和等值線進行分析，研究因子與響應面之間、因子與因子之間的相互關系[5]。具有實驗次數(shù)少、實驗精度高等特點[6]。

亞硝酸鹽具有致畸、致癌、致甲狀腺腫大等危害。大劑量的亞硝酸鹽能夠引起高鐵血紅蛋白癥，導致組織缺氧，還可使血管擴張、血壓降低[7]。成人中毒劑量為0.3～0.5 g，致死量為1～3 g[8]。亞硝酸鹽為強氧化劑，進入人體后，可使血中低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，失去運氧的功能，致使組織缺氧，身體出現(xiàn)青紫而中毒。亞硝酸鹽是亞硝胺類化合物的前體物質。

亞硝胺是強致癌物，亞硝胺類化合物就是世界公認的強致癌食品污染物。大量動物實驗已確認，亞硝胺是強致癌物，并能通過胎盤和乳汁引發(fā)后代腫瘤[9]。同時，亞硝胺還有致畸和致突變作用，人群中流行病學調查表明，人類某些癌癥，如胃癌、食道癌、肝癌、結腸癌和膀胱癌等可能與亞硝胺有關[10]。因此，研究出清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的有效物質已成為研究防癌防腫瘤藥物的重中之重。

本文研究了單因素料液比、超聲時間和乙醇體積分數(shù)對木蝴蝶總黃酮的提取率的影響，采用了超聲提取技術[11]提取總黃酮成分。利用響應面分析法優(yōu)化了木蝴蝶總黃酮的提取工藝。在此基礎上研究了木蝴蝶總黃酮對亞硝酸鈉的最大清除率及阻斷亞硝胺合成的最佳效果，并與水提液、精油和大蒜做了對比研究，對清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究具有一定的參考價值。

1儀器與試藥

1.1儀器紫外-可見分光光度儀(美國熱電公司 Analytik jena specord 50)；AB204-S型萬分之一電子天平,DHG-9075A型電熱恒溫鼓風干燥箱鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)；超聲水浴鍋(上海科導超聲儀器有限公司SK82002H型超聲水浴鍋)；真空泵。

1.2試藥木蝴蝶藥材(河北春開制藥股份有限公司)；蘆丁對照品(上海士鋒科技有限公司，20140212)；無水乙醇、亞硝酸鈉、無水硫酸鈉(分析純，天津市百世化工有限公司)；硝酸鋁、氫氧化鈉、二氯甲烷、磷酸氫二鈉(分析純，煙臺市雙雙化工有限公司)；檸檬酸(分析純，湖南匯虹試劑有限公司)；對氨基苯磺酸(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)；鹽酸萘乙二胺(分析純，天津市永大化學試劑有限公司)；氨基磺酸銨(分析純，杭州金菌克生物制品有限公司)；硫酸(分析純，宜興市輝煌化學試劑廠)。

2方法與結果

2.1總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.1.1總黃酮提取標準曲線的繪制蘆丁標準溶液的配制：精密稱定蘆丁對照品5 mg ，用體積分數(shù)為60%的乙醇定容至50 mL量瓶中，搖勻，靜置，得到100 μg·mg-1的蘆丁標準溶液[12]。

最大波長的選擇：精密量取蘆丁標準溶液2.0 mL，置于10 mL量瓶中，加入體積分數(shù)為60%的乙醇溶液5 mL，搖勻，加入50 g·L-1的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入100 g·L-1的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入1.5 mL氫氧化鈉溶液，再加入體積分數(shù)為60%的乙醇溶液定容，靜置20 min。以空白組做參比，在190～1 100 nm波長范圍內進行紫外光譜掃描，確定最大吸收波長為505 nm。

標準曲線的制作：分別精密量取對照品溶液0,1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL,置于10 mL量瓶中，各加入體積分數(shù)60%的乙醇溶液5 mL，搖勻，加入50 g·L-1的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入100 g·L-1的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入1.5 mL氫氧化鈉溶液，再加入體積分數(shù)為60%的乙醇定容，靜置20 min，以空白組做參比，在505 nm波長處測定吸光度[13]。以不同體積的對照品溶液對吸光度進行回歸得蘆丁標準曲線，標準曲線的相對標準偏差為0.999 7，符合實驗標準。

2.1.2木蝴蝶總黃酮提取液的制備精確稱量木蝴蝶樣品1.0 g,置于燒杯中，加入體積分數(shù)60%的乙醇溶液50 mL，在40 ℃水浴下超聲100 min。抽濾完全后，將濾液置于100 mL量瓶中，并用體積分數(shù)60%的乙醇溶液定容至100 mL。

2.1.3重復性與穩(wěn)定性實驗重復性實驗：準確稱量5份質量為1.0 g的木蝴蝶粉末，按2.1.2中所述方法制備總黃酮的提取液，分別準確移取2 mL按2.1.1項下所述的方法配置，定容于10 mL量瓶中，在已確定的波長下測其吸光度，計算RSD值。

穩(wěn)定性實驗：準確移取總黃酮提取液2 mL，按2.2.1中所述的方法配置，定容于10 mL量瓶中，在已確定的波長下測其吸光度，每隔10 min測1次，共測5次，計算RSD。

2.1.4單因素實驗料液比對總黃酮提取的影響：配制體積分數(shù)為60%的乙醇溶液。精密稱量木蝴蝶樣品1.000 g,5份，分別置于燒杯中，編號1～5，分別加入體積分數(shù)60%的乙醇溶液20，30，40，50和60 mL，在40 ℃水浴下超聲20 min。抽濾完全后，將濾液置于100 mL量瓶中，加入50 g·L-1的亞硝酸鈉溶液3 mL，搖勻，靜置6 min，加100 g·L-1氫氧化鈉溶液15 mL，搖勻，靜置20 min，測其吸光度值[14]。以空白組做參比。

分析料液比對木蝴蝶總黃酮提取率的影響。從實驗結果可以得出，料液比為1∶50時，木蝴蝶總黃酮的提取率最高，若料液比繼續(xù)升高，提取率不再增高，達到了最佳料液比。實驗表明，料液比為1∶50時為最佳。

超聲時間對總黃酮提取的影響：配制體積分數(shù)60%的乙醇溶液。精密稱取木蝴蝶樣品1.000 g，7份，分別置于燒杯中，編號1～7。加入體積分數(shù)60%的乙醇溶液30 mL，在40 ℃水浴下分別依次超聲20，40，60，80，120和140 min。抽濾完全后，取濾液置于50 mL量瓶中，加入1.5 mL 50 g·L-1的亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，加入1.5 mL 100 g·L-1的亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，加入7.5 mL 100 g·L-1的氫氧化鈉溶液，搖勻，加入乙醇溶液定容至50 mL，靜置20 min[14]。以空白組做參比，在505 nm波長下測其吸光度。

分析超聲時間對木蝴蝶總黃酮提取率的影響。從實驗結果可以得出，超聲時間為120 min時，木蝴蝶總黃酮的提取率為峰值，超聲時間繼續(xù)增加，提取率不再增高，達到了最佳超聲時間。實驗表明，超聲時間120 min時為最佳。

不同體積分數(shù)的乙醇溶液對總黃酮提取的影響：配制體積分數(shù)為30%，40%，50%，60%和70%的乙醇溶液，精密稱取木蝴蝶樣品1.000 g,5份,分別置于5個50 mL的量瓶中，編號1～5，并向5個量瓶中分別加入上述配制好的乙醇溶液30 mL，在40 ℃水浴中超聲20 min，抽濾完全后，取濾液置于50 mL量瓶中，加入1.5 mL 50 g·L-1的亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，加入1.5 mL 100 g·L-1硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，最后加入7.5 mL 100 g·L-1的氫氧化鈉溶液，加入各自對應體積分數(shù)的乙醇定容至50 mL，靜置20 min[14]。以空白組做參比，在505 nm波長下測其吸光度。

分析乙醇的體積分數(shù)對木蝴蝶總黃酮提取率的影響。從實驗結果可以看出，乙醇溶液的體積分數(shù)為50%時，木蝴蝶總黃酮提取率達到最大值，當繼續(xù)增加乙醇的體積分數(shù)時，提取率不再增加，達到了最佳乙醇體積分數(shù)。實驗表明，乙醇體積分數(shù)為50%時為最佳。

2.1.5響應面分析法優(yōu)化總黃酮提取根據(jù)響應面設計原理，結合響應面分析方法，綜合單因素實驗結果，以乙醇體積分數(shù)(X1)、料液比(X2)、超聲時間(X3)3個因素為自變量，總黃酮吸光度為響應值，設計3因素5水平共17個實驗點(其中14個為析因實驗，3個為中心實驗)的響應面分析實驗[15]。對乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間按下列公式進行編碼：X1=(X1-50)/10，X2=(X2-50)/20，X3=(X3-120)/20。響應面因素水平編碼見表1；響應面分析實驗結果見表2；方差分析見表3。

表1響應面因素水平編碼

Tab.1 The level coding of response surface factor

項目-10(水平)+1X1,乙醇體積分數(shù)/%405060X2,料液比305070X3,超聲時間/min100120140

表2響應面分析實驗結果

Tab.2 The results of response surface analysis

X1,乙醇體積分數(shù)/%X2,料液比X3,超聲時間/minR1-10+10.556720000.57923-10-10.566740000.59005+1+100.468260000.57067-1-100.531780+1+10.528890+1-10.546110+10+10.4604110000.596112-1+100.5043130-1+10.435814+1-100.2778150-1-10.3959160000.581417+10-10.3833

表3木蝴蝶中總黃酮吸光度方差分析結果

Tab.3 The results of the orthogonal of variance analysis

來源平方和自由度均方和FPX1X2X3X1X2X1X3X2X3X21X22X23殘差失擬項誤差總離差模型0.0410.0211.006E-0030.0121.897E-0038.180E-0040.0160.0253.857E-0031.455E-0031.065E-0033.903E-0040.130.131111111117341690.0410.0211.006E-0030.0121.897E-0038.180E-0040.0160.0253.857E-0032.079E-0043.594E-0049.758E-0050.014195.1799.224.8457.059.123.9376.41118.6718.563.64<0.0001<0.0001<0.06380.00010.01940.0887<0.0001<0.00010.00350.1222<0.0001

應用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到乙醇體積分數(shù)(X1)、料液比(X2)、超聲時間(X3)與木蝴蝶中總黃酮之間的二次多項回歸方程：

由表3可知，一次項中乙醇體積分數(shù)、料液比對總黃酮吸光度的線性效應極其顯著，各因素對總黃酮吸光度的影響大小為X1>X2>X3；二次項中乙醇體積分數(shù)、料液比對總黃酮吸光度的線性效應極其顯著，料液比對總黃酮吸光度的線性效應高度顯著；交互項中乙醇體積分數(shù)與料液比、乙醇體積分數(shù)與超聲時間對總黃酮吸光度的線性效應顯著。此外，在本實驗設計范圍內，回歸方程的失擬項檢測P=0.103 9>0.05，不顯著；回歸方程顯著性檢測P<0.001，極顯著，證明應用響應面法優(yōu)化的提取工藝提取木蝴蝶中總黃酮是可行的。

圖1各因素對木蝴蝶中總黃酮得率影響的二維等高線和三維響應面曲線

A.乙醇體積分數(shù)和超聲時間對總黃酮提取的影響；B.料液比和超聲時間對總黃酮提取的影響；C.乙醇體積分數(shù)和料液比對總黃酮提取的影響

Fig.1The two-dimensional and three-dimensional response surface contour curves of the total flavonoids yield ofOroxylumindicum(L) Vent factors

A. effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the extraction of total flavonoids；B. effect of feed liquid ratio and ultrasonic time on the extraction of total flavonoids；C. the ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction effect of total flavonoids.

2.2亞硝酸鈉的清除及亞硝胺合成的阻斷研究

2.2.1亞硝酸鈉標準曲線的制作吸取0.4 mL的亞硝酸鈉標準溶液(相當于2 μg亞硝酸鈉)，置于50 mL量瓶中，各加入pH=3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉2.0 mL，在37 ℃水浴1 h，取出，立即加入4 g·L-1的氨基苯磺酸2 mL混勻，靜置3～5 min,各加1 mL 2 g·L-1的鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，靜置15 min，測吸光度。確定最大吸收波長為538 nm。

吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0和2.5 mL的亞硝酸鈉標準溶液(相當于0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，7.5，10.0和12.5 μg的亞硝酸鈉)，分別置于50 mL量瓶中，各加入pH=3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉2.0 mL，在37 ℃水浴1 h，取出，立即加入4 g·L-1的對氨基苯磺酸2 mL混勻，靜置3～5 min，各加1 mL 2 g·L-1的鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，靜置15 min，測吸光度[16]。以亞硝酸鈉標準溶液的體積分數(shù)對吸光度回歸，得到相對標準偏差為0.999 3，符合實驗標準。

2.2.2亞硝酸鈉清除率測定-鹽酸萘乙二胺法分別吸取5 μg·L-1的亞硝酸鈉標準溶液1 mL,置于標號為1，2，3，4和5的50 mL量瓶中，依次加入pH=3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液2 mL，樣液2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL，在37 ℃水浴1 h，取出，立即加入4.0 g·L-1的對氨基苯磺酸2 mL，混勻，靜置3～5 min，加入1.0 mL 2.0 g·L-1的鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，靜置15 min，在538 nm處測其吸光度A，平行做3次求平均值，同時做空白對照實驗[17]。

亞硝酸鹽清除率(%)=(N空-N殘)/N空×100%

2.2.3木蝴蝶總黃酮精油、水提液及大蒜醇提物對亞硝酸鈉清除率測定木蝴蝶總黃酮、精油、水提液及大蒜醇提物對亞硝酸鈉清除率與不同體積的樣液之間的關系如圖2所示。

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圖2總黃酮、水提液、精油和大蒜對亞硝酸鹽清除率的折線圖

Fig.2The curves of total flavonoids，water extract，essential oil and garlic to nitrite scavenging rate

由圖2可知,總黃酮對亞硝酸鈉的最大清除率可以達到65.3%。從折線圖的走勢來看，亞硝酸鈉的清除率隨樣液體積的增加而逐漸增大，達到最大清除率后，清除率逐漸穩(wěn)定。水提液的清除效果低于總黃酮，精油的清除效果較好。

2.2.4亞硝胺合成阻斷率測定分別吸取5 μg·mL-1的亞硝酸鈉標準溶液1 mL，置于標為1，2，3，4和5的50 mL量瓶中，依次加入pH為3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液2 mL及樣液2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL，在37 ℃水浴1 h，取出，立即加入2.0 g·L-1的氨基磺酸銨1 mL和2.5 mol·L-1的硫酸1 mL終止反應，再用二氯甲烷提取(提取4次)。后用無水硫酸鈉(0.1 g∶5 mL)脫水，靜置5 min，過濾[18]。在538 nm處測定吸光度A1，平行做3次求平均值，同時做空白對照實驗。由于樣液顏色的影響，為了減小誤差，做了以下實驗，即用樣液2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL分別加入5.0，6.0，7.0，8.0和9.0 mL的蒸餾水使得測吸光度時樣液的濃度一致，測得吸光度A2。結果如圖3所示。

亞硝胺阻斷率(%)=(A空-A1+A2)/A空×100%

2.2.5木蝴蝶總黃酮精油、水提液及大蒜醇提物亞硝胺合成阻斷率測定木蝴蝶總黃酮、精油、水提液及大蒜醇提物對亞硝胺合成阻斷率與不同體積的樣液之間的關系如圖3所示。

圖3總黃酮、水提液、精油和大蒜對亞硝胺合成阻斷率的折線圖

Fig.3The curves of total flavonoids，water extract oil and garlic to nitrosamine synthesis blocking rate

由亞硝胺合成阻斷率與不同體積的樣液之間的關系(圖3)可知,總黃酮對亞硝胺的最大阻斷率可以達到58.5%。從折線圖的走勢來看，亞硝胺的最大阻斷率隨樣液體積的增加而逐漸增大，達到最大阻斷率后，阻斷率逐漸穩(wěn)定。水提液的阻斷能力低于總黃酮，總黃酮的最大阻斷能力接近大蒜。

3結論

實驗中通過單因素實驗得到了影響總黃酮提取的3個因素，采用響應面分析法進行優(yōu)化，應用Design-Expert軟件，得出了最佳的提取條件為：超聲時間為119 min，料液比為1∶53，乙醇體積分數(shù)為45%。

由實驗結果可知，木蝴蝶中的總黃酮成分對亞硝酸鈉的清除率高達65.3%，對亞硝胺的合成阻斷率高達58.5%。由此可見，木蝴蝶對亞硝酸鈉具有較優(yōu)的清除能力，并對亞硝胺的合成具有較強的阻斷效果。

在體外條件下，比較了木蝴蝶中總黃酮清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺合成的最大值，結果:木蝴蝶總黃酮、水提液、精油和大蒜對亞硝酸鹽的清除率分別為65.3%，42.2%，71.2%和41.9%；對亞硝胺合成阻斷率分別為58.5%,30.9%,36.7%和64.1%。

在體外條件下，木蝴蝶中總黃酮對亞硝酸鹽的清除率略低于精油，但高于大蒜，達到了65.3%。同時抑制亞硝化反應的效果高達58.5%，高于精油，其阻斷率接近大蒜，總黃酮的清除效果和阻斷能力高于水提液。這表明：體外條件下，木蝴蝶中總黃酮具有較好的清除能力和阻斷效果。

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