·中醫(yī)·中西醫(yī)結合研究·

不同證候噎膈患者血清調控食管癌EC9706細胞PI3K/Akt/NF-κB信號通路差異分析

賈永森，林清，秦麗娟，張艷麗，劉春秋，江春花，閆昕，曹慧娟

作者單位：063000 河北省唐山市，華北理工大學中醫(yī)學院(賈永森，林清，江春花，閆昕，曹慧娟)；華北理工大學基礎醫(yī)學院(秦麗娟)；遷安燕山醫(yī)院(張艷麗)；唐山市人民醫(yī)院(劉春秋)

通信作者：秦麗娟，063000 河北省唐山市，華北理工大學基礎醫(yī)學院；E-mail：qinlj20012003@163.com

【摘要】目的通過研究噎膈血瘀證、脾氣虛證患者及健康人血清對食管癌EC9706細胞增殖、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/核因子kappaB(NF-κB)信號通路相關分子mRNA及蛋白表達的調控，探討噎膈血瘀證、脾氣虛證的分子機制。方法本研究于2014年6—12月選擇來源于唐山市人民醫(yī)院、遷安燕山醫(yī)院腫瘤內科的病理確診的食管鱗癌患者。按照《中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標準——中醫(yī)病癥診斷療效標準》確定噎膈血瘀證或脾氣虛證標準，選取血瘀證、脾氣虛證患者各10人，另選取健康志愿者10人(來自兩院體檢人員)。將EC9706細胞于37 ℃，5%飽和濕度的二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱孵育24 h，饑餓24 h，分別加入倍比梯度的噎膈血瘀證、脾氣虛證患者和健康人血清，噻唑藍(MTT)染色法檢測細胞增殖變化；實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測PI3K、Akt、NF-kB表達；免疫印跡(Western blot)法檢測PI3K/Akt/NF-κB信號通路相關分子蛋白表達。結果血瘀證患者血清刺激細胞的50%增殖率為71.1 μl/ml，脾氣虛證為118.0 μl/ml；血瘀證患者血清上調細胞PI3K、Akt和NF-κB mRNA表達水平，與各對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，脾氣虛證患者血清無上調mRNAs作用；血瘀證患者血清促進細胞表皮生長因子受體(EGFR)、PI3K、Akt、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)和 NF-κB等蛋白表達水平增高，與各對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，脾氣虛證患者血清無促進此五蛋白表達作用。結論噎膈血瘀證患者血清能夠促進細胞增殖，該證候的分子機制可能與PI3K/Akt/NF-κB信號通路過度激活有關；脾氣虛證患者血清無刺激細胞增殖作用，其證候分子機制有待探討。

【關鍵詞】食管腫瘤；血瘀證；脾氣虛證；血清；EC9706細胞

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81101912)；河北省自然科學基金資助項目(H2013209053)

【中圖分類號】R 735.1

收稿日期：(2015-08-11；修改日期：2015-10-15)

賈永森，林清，秦麗娟，等.不同證候噎膈患者血清調控食管癌EC9706細胞PI3K/Akt/NF-κB信號通路差異分析[J].中國全科醫(yī)學，2015，18(34)：4261-4265.[www.chinagp.net]

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Regulation of Sera From Esophageal Cancer Patients With Different Syndromes on Cell Proliferation and PI3K/Akt/NF-κB Signaling Pathway of Esophageal Carcinoma EC9706 CellsJIAYong-sen,LINQing,QINLi-juan,etal.CollegeofTraditionalChineseMedicine,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the molecular mechanisms of Blood-Stagnation Syndrome (BSS) and spleen-Qi-dificiency syndrome (SQDS) patients with Esophageal cancer (EC) through observation on cells proliferation,mRNAs and proteins expression in PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway regulated by sera from patients.MethodsFrom June to December,2014,we enrolled patients who were definitely diagnosed with esophageal squamous cell carcinoma in oncology department of Tangshan People′s Hospital and Yanshan Hospital.According to TCM Professional Standard of People′s Republic of China/ TCM diagnosis and efficacy standard,we determined the standard of blood stasis syndrome and spleen-yang deficiency syndrome in patients with dysphagia.We enrolled 10 patients of blood stasis syndrome,10 patients with spleen-yang deficiency syndrome,and another 10 healthy controls (people who received physical examination from the two hospitals).EC9706 cells were put into CO2incubator with a temperature of 37 ℃ and a saturation humidity of 5% and were cultured for 24 hours and kept hungury for 24 hours.Then serum of patients of blood stasis syndrome and spleen-yang deficiency syndrome and healthy controls was put into the incubator by proportional gradient,and MTT staining method was used to detect the changes in cell proliferation;the expression levels of PI3K,Akt and NF-κB mRNA were measured by Real-time PCR,and the protein expression of relevant molecules of PI3K/Akt/NF-κB signalling pathway was detected by Western blot method.ResultsHalf maximal (50%) promotion concentration (PC50) of BSS was 71.1 μl/ml,PC50 of SQDS was 118.0 μl/ml.Sera from BSS patients promoted PI3K,Akt and NF-κB mRNAs expression,being significantly different from those in control group (P<0.05),however,sera from SQDS patients didn′t work.Western blot assay showed that BSS patients′ sera stimulated over-expression of EGFR,PI3K,Akt,p-Akt and NF-κB,showing significant difference from control group(P<0.05),however,sera from SQDS patients didn′t work.ConclusionSera from BSS patients stimulates EC9706 cells proliferation.Molecular hypostasis of BSS relates to over-activation of PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway.Sera from SQDS patients can′t stimulate EC9706 cells proliferation,and molecular hypostasis of it needs further study.

【Key words】Esophageal neoplasms;Blood-stagnation syndrome;Spleen-qi-dificiency syndrome;Serum;EC9706 cells

噎膈是以進食時吞咽困難、哽咽不順、飲食難下或食入即吐為主癥的疾病，與現代醫(yī)學食管癌的表現十分相似[1]。有研究對噎膈中醫(yī)證型的分布規(guī)律進行分析，結果顯示血瘀證占所有證型的50%左右[2]；同時，脾氣虛證在食管癌形成和轉移過程中起著至關重要的作用[3-4]，血瘀和氣虛是食管癌中醫(yī)病機非常重要的兩個方面。近年來，中醫(yī)藥辨證抗癌越來越顯示出獨特優(yōu)勢，但辨證的宏觀性、經驗性亟待微觀、客觀證據的支持。本研究以健康志愿者血清為對照，觀察了噎膈血瘀證、脾氣虛證患者血清對食管癌EC9706細胞增殖及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/核因子kappaB(NF-kB)信號通路關鍵分子mRNA和蛋白表達的影響，以期揭示噎膈血瘀證、脾氣虛證血液微環(huán)境的證候分子機制。

1對象與方法

1.1研究對象臨床病理確診食管癌患者中95%以上為鱗癌。本研究于2014年6—12月選擇唐山市人民醫(yī)院、遷安燕山醫(yī)院腫瘤內科的病理確診食管鱗癌患者。按照《中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標準——中醫(yī)病癥診斷療效標準》[5]確定噎膈血瘀證或脾氣虛證標準，由3名獨立調查員執(zhí)行辨證，選取血瘀證、脾氣虛證患者各10人分別為血瘀證組、脾氣虛證組，另選取上述醫(yī)院的健康志愿者10人為健康組?；颊呒{入標準：(1)符合食管鱗癌病理診斷；(2)符合噎嗝血瘀證或脾氣虛證中醫(yī)證候診斷；(3)年齡為55～85歲。排除標準：(1)不符合上述西醫(yī)診斷標準及中醫(yī)辨證標準者；(2)已接受普通藥物治療、手術治療或放化療者；(3)不愿接受研究措施或其他原因不能合作者。本研究通過了華北理工大學醫(yī)學倫理審查委員會的批準，入選者均簽署知情同意書。

1.2試劑與儀器人食管癌EC9706細胞株(購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心)；RPMI1640培養(yǎng)液(GIBCO公司)；新生牛血清(BCS，GIBCO公司)；胰蛋白酶(GIBCO公司)；噻唑藍(MTT，Amresco公司)；二甲基亞砜(DMSO，Amresco公司)；Trizol裂解液、互補脫氧核糖核酸(cDNA)合成和熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒(ABI Ambion公司)；引物(上海捷瑞生物工程有限公司)；兔抗人表皮生長因子受體(EGFR)多克隆抗體；鼠抗人PI3K單克隆抗體；兔抗人Akt多克隆抗體；兔抗人磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)多克隆抗體；兔抗人NF-κB多克隆抗體(以上5抗體均產自CST公司)；山羊抗小鼠辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G(IgG-HRP,華美生物工程公司)；山羊抗兔IgG-HRP(華美生物工程公司)；1100型單人超凈工作臺(FORMA公司)；NOVAPATH 450型酶標光度計(Bio-Tek公司)；JY92-IID型超聲波細胞破碎儀(新芝公司)；3336型CO2培養(yǎng)箱(FORMA公司)；TMD-2型倒置式顯微鏡(NIKON公司)；3MK型低溫高速離心機(SIGMA公司)；Lightcycler 480型實時定量PCR儀(ROCHE公司)；AE-6531型垂直電泳儀(ATTO公司)；GEL-DOC-2000型凝膠掃描分析系統(tǒng)(BIO-RAD公司)。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng)以10%BCS RPMI 1640培養(yǎng)液10 ml，接種EC9706細胞于Φ100 mm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5%二氧化碳(CO2)，飽和濕度的培養(yǎng)箱孵育。

1.3.2人血清采集及處理晨起6：00時，抽取患者和健康人空腹血10 ml，室溫靜置30 min，3 000 r/min 4 ℃離心15 min，離心半徑為10 cm。56 ℃水浴滅活，按單個患者1.5 ml離心管分裝。血清的處理采用甲醇沉淀蛋白法：1 ml人血清，加3 ml甲醇，充分混勻后4 ℃靜置過夜，3 000 r/min 4 ℃離心15 min，離心半徑為10 cm。取上清液，氮吹儀37 ℃水浴揮干，加1 ml含2%BCS RPMI 1640培養(yǎng)基復溶，一次性無菌濾器(0.22 μm)過濾除菌，各病例血清單獨保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3MTT法以1×104個細胞/孔的密度接種于96孔平面培養(yǎng)板，含10%BCS培養(yǎng)液使細胞貼壁24 h后，去除BCS，饑餓細胞24 h，隨機選取血瘀證、脾氣虛證患者和健康人血清各1例，以RPMI1640培養(yǎng)液配制如下梯度濃度：3.125，6.25，12.5，25，50，100 μl/ml孵育細胞；空白對照組以不含血清培養(yǎng)液孵育細胞作為平行對照。每組均設置3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。去上清液，每孔加100 μl含有0.2 mg/ml MTT的磷酸鹽緩沖液(PBS)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清，加入150 μl DMSO溶解MTT，搖床上混勻15 min，酶標儀上以570 nm/630 nm測定光密度(OD)值。按照公式：腫瘤細胞生長增殖率=(實驗組OD值/對照組OD值-1)×100%[6]，計算各血清對腫瘤細胞生長的增殖率，據曲線擬合方程[7]求出人血清干預的3組細胞半數增殖濃度(PC50)值。使用各組內其他9例血清樣本重復進行MTT實驗，分別求得PC50后取均值即為各組的PC50值。分別以3組內各樣品PC50血清濃度干預各組細胞，分別提取總RNA和總蛋白，進行實時熒光定量PCR和免疫印跡(Western blot) 檢測。

1.3.4實時熒光定量PCR按照Trizol試劑說明提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測定其濃度和純度，將RNA進行逆轉錄。PCR反應體系：SYBR熒光染料 12 μl，cDNA 2 μl，Rnase-free Milliq水 8 μl。反應條件：96 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s，循環(huán)40次。引物序列如下：PI3K，上游：5′-GCACCTGAATAGGCAAGTC-3′，下游：5′-TCGCACCACCTCAATAAGT-3′；Akt，上游：5′-TTTGAAGA

GCGGCCC- TGTC-3′，下游：5′-CGGTATAGCAATTGTACA

T-3′；NF-κB，上游：5′-GAGAGCCCTT- GCCTCCTTT-3′，下游：5′-CTTCCCTTTGGTCTTTCTG-3′。β-actin，上游：5′-CACTGT- GTTGGCGTACAGG-3′，下游：5′-TCATCACCATTGGCAATGA-3′。將各組內10例血清標本均進行本實驗。

1.3.5蛋白提取與Western blot分析將各組細胞冰上收集，離心，裂解細胞；3 000 rpm離心20 min 4℃；取上清。Bradford法測蛋白濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?% SDS-PAGE(分離膠)和積層膠。灌膠、上樣、電泳，轉移過夜。轉移結束后，加麗春紅染料染色，標記標準蛋白分子量。加封閉液在搖床上，振搖1 h，阻斷膜上的非特異性結合位點；抗原抗體反應；加入ECL顯色液，X線攝片。將各組內10例血清標本均進行本實驗，結果進行組間比較，并做統(tǒng)計學分析。

2結果

2.1人血清對食管癌EC9706細胞增殖的影響將6個不同梯度濃度的人血清加入RPMI1640培養(yǎng)液中孵育細胞，3組血清分別干預的食管癌EC9706細胞均呈增殖趨勢。據細胞增殖率得到各組曲線擬合方程如下：血瘀證組Y=-0.928+0.099x+(-1.5×10-5)x2+(-3.3×10-8)x3,PC50=71.1 μl/ml；脾氣虛證組Y=-1.525+0.073x+(-2.2×10-5)x2+(-3.3×10-9)x3，PC50=118.0 μl/ml；健康人組Y=0.245+0.04x,PC50=124.3 μl/ml。方程式中，Y為細胞增殖率，x為血清濃度(見圖1)。在血清濃度為25～100 μl/ml時，3組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；血瘀證組細胞增殖率與其他兩組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2人血清對EC9706細胞PI3K、Akt和NF-κB mRNA表達的影響Real time PCR法測定顯示，噎膈血瘀證組血清干預的EC9706細胞，PI3K、Akt和NF-κB mRNA表達顯著增強(見圖2)，3指標相對含量與其他三組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。脾氣虛證組與空白對照組和健康人組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表2)。

圖1　人血清對EC9706細胞增殖作用的量效關系曲線擬合圖

組別例數3.125μl/ml6.25μl/ml12.5μl/ml25μl/ml50μl/ml100μl/ml血瘀證組101.79±0.845.45±1.9612.03±2.3123.14±3.97ab42.75±4.88ab51.16±4.52ab脾氣虛證組101.15±0.532.81±0.997.86±2.7116.23±4.6427.80±4.0743.95±5.71健康人組100.67±0.301.87±0.633.99±1.456.35±2.1921.74±5.1138.08±4.90F值14.73238.69383.7081245.669539.475541.791P值0.1620.0740.0580.0270.0430.041

注：與脾氣虛證比較，aP<0.05；與健康人比較，bP<0.05

2.3人血清對EC9706細胞PI3K/Akt/NF-κB信號通路蛋白表達的影響Western blot法分析顯示，噎膈患者血清干預的食管癌EC9706細胞PI3K/Akt信號通路蛋白表達均不同程度地增強(見圖3)。血瘀證組與空白對照組、健康人組比較，EGFR、PI3K、Akt、p-Akt和 NF-κB蛋白相對灰度值均顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而脾氣虛證組與空白對照組和健康人組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>,見表3)。

3討論

中醫(yī)理論認為，氣血關系密切，血行脈中賴氣以推動，故有“氣以行血”之論。氣虛則不能行血導致血瘀證，這種內在機制為血瘀的形成奠定了基礎。臨床資料表明，食管癌患者初期大多表現為血瘀證候，到中后期時，證候演變?yōu)槠馓撟C，兩證型占食管癌證候分型的半數以上[8]。因此，探討兩證型的分子機制對于認識食管癌證候演變規(guī)律具有重要意義。

注：PI3K=磷脂酰肌醇3-激酶，Akt=蛋白激酶B，NF-kB=核因子kappaB

圖2人血清對EC9706細胞PI3K、Akt和NF-κB mRNA表達的影響柱形圖

Figure 2Column diagram about effect of human sera on mRNAs expression of PI3K、Akt and NF-κB in EC9706 cells

Table 2Effect of human sera on mRNAs expression of PI3K、Akt and NF-κB in EC9706 cells

組別例數PI3KAktNF-κB空白對照組1.13±0.230.73±0.161.03±0.24血瘀證組102.42±0.41abc1.45±0.39abc2.10±0.35abc脾氣虛證組101.05±0.140.92±0.220.92±0.13健康人組100.89±0.210.76±0.190.94±0.21F值493.349118.779621.306P值0.0280.0390.045

注：PI3K=磷脂酰肌醇3-激酶，Akt=蛋白激酶B，NF-kB=核因子kappaB；空白對照，無血清；血瘀型噎膈患者血清濃度=71.1 μl/ml；脾氣虛型噎膈患者血清濃度=118.0 μl/ml；健康人血清濃度=124.3 μl/ml。與空白對照比較，aP<0.05；與脾氣虛證比較，bP<0.05；與健康人比較，cP<0.05

注：EGFR=生長因子受體，p-Akt=磷酸化-蛋白激酶B，β-actin=β-肌動蛋；A為空白對照，無血清；B為血瘀型噎膈患者血清濃度=71.1 μl/ml；C為脾氣虛型噎膈患者，血清濃度=118.0 μl/ml；D為健康人血清濃度=124.3 μl/ml

圖3人血清對EC9706細胞 PI3K/Akt信號通路蛋白表達的影響

Figure 3Effect of human sera on protein expression in PI3K/Akt signaling pathway in EC9706 cells

表3　人血清影響EC9706細胞PI3K/Akt信號通路各蛋白表達相對灰度值 ±s)

注：EGFR=生長因子受體，p-Akt=磷酸化-蛋白激酶B，β-actin=β-肌動蛋白；血瘀型噎膈患者血清濃度=71.1 μl/ml；脾氣虛型噎膈患者血清濃度=118.0 μl/ml；健康人血清濃度=124.3 μl/ml；與空白對照比較，aP<0.05；與脾氣虛證比較，bP<0.05；與健康人比較，cP<0.05

近年來，惡性腫瘤中醫(yī)證候分子機制的研究成為熱點，但不同證候腫瘤患者血液微環(huán)境差異以及相關分子機制的報道甚少。人體內外各種因素引起血液環(huán)境改變，而血液又反作用于腫瘤細胞[9]。如同其他惡性腫瘤一樣，不同證候食管癌的發(fā)生與患者血液微環(huán)境的改變關系密切。本研究著眼于不同噎膈證候血液微環(huán)境差異，觀察噎膈血瘀證、脾氣虛證微環(huán)境對鱗癌細胞的干預作用，以探討食管癌血瘀、氣虛證候的分子機制。

MTT法檢測表明，噎膈血瘀證患者血清顯著刺激EC9706細胞增殖，其PC50值為71.1 μl/ml培養(yǎng)液體積；而脾氣虛證患者PC50為118.0 μl/ml。在血清濃度為25~100 μl/ml時，血瘀證組細胞增殖率均明顯高于脾氣虛組細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明血瘀證噎膈患者血清顯著刺激細胞增殖，而脾氣虛證患者血清對癌細胞的促增殖作用較小。本研究采用PC50濃度值作為衡量證候血清刺激細胞增殖差異的指標，主要基于細胞毒藥物抑制細胞實驗。眾所周知，PC50值被業(yè)界廣泛應用于抗癌藥物抑制腫瘤細胞的研究，已經成為相關研究的金指標之一。本實驗觀察了不同證候患者血清影響食管癌EC9706細胞的分子機制，為了更科學、準確地反映證候血清的作用差異，不同組別細胞增殖程度須保持一致，這是比較證候間分子機制差異的重要前提。因此，選擇PC50濃度的證候血清保證了組間比較時干預因素的同一性和可比性。

PI3K/Akt/NF-κB信號通路與癌癥的發(fā)生發(fā)展、轉移關系密切；食管癌多種腫瘤都可以激活此通路[10]。以EGFR為代表的生長因子受體激活PI3K產生第二信使。Akt是PI3K下游僅有的可促進細胞進行惡性轉化的蛋白，Akt的磷酸化(p-Akt)進一步激活NF-κB[11]。NF-κB是多種生理和病理過程的關鍵轉錄因子，它的一個特定功能是通過誘導靶基因來促進細胞存活，其產物可抑制正常細胞和癌細胞的細胞凋亡[12]。NF-κB的活性被激活后，可啟動下游分子如TNF-α、IL-1β等，從而促進腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉移。

本實驗運用實時熒光定量PCR和Western blot法檢測了空白對照組、噎膈血瘀證患者血清組、脾氣虛證組和健康人組中PI3K/Akt/NF-κB信號通路相關因子表達。實時熒光定量PCR檢測顯示，噎膈血瘀證血清干預的EC9706細胞，PI3K、Akt和NF-κB mRNA表達顯著增強，與其他三組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而脾氣虛證患者血清干預的細胞3指標無增高，與空白對照和健康人血清干預作用比較無統(tǒng)計學意義。表明噎膈血瘀證候微環(huán)境在RNA水平上調了相關因子的轉錄水平。Western blot結果顯示噎膈血瘀證患者血清干預的細胞PI3K/Akt/NF-κB信號通路EGFR、PI3K、Akt、p-Akt和 NF-κB蛋白表達均顯著增強，與空白對照組、健康人組血清組干預細胞的蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，顯示出了證候血清的多靶點刺激效應。而脾氣虛證患者血清干預的細胞5個指標無增高，與空白對照和健康人血清干預作用比較無統(tǒng)計學意義。表明噎膈血瘀證患者的血清對PI3K/Akt/NF-κB信號通路各蛋白具有特征性促表達作用，而以脾氣虛證為代表的噎膈患者血清對食管癌細胞的PI3K/Akt/NF-κB信號通路刺激作用較弱。因此，本研究組提出噎膈血瘀證“PI3K-NF-κB證候分子標志物”的概念，即噎膈患者體內PI3K/Akt/NF-κB信號通路的過表達與血瘀證候密切相關。

本實驗從細胞增殖、PI3K/Akt/NF-κB信號通路mRNAs和蛋白表達等角度研究了不同證候噎膈患者血清對食管癌EC9706細胞的干預作用和分子機制。需要指出的是，噎膈不同證候的形成是很復雜的，其他相關和更深層次的機制值得深入研究。

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(本文編輯：石變華)