蛇床子素對轉染APP595/596基因的SH-SY5Y細胞的保護作用*

教亞男，姚瓔珈，孔亮，李少恒，陶震宇，閆宇輝，楊靜嫻△

(遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 大連116600)

[摘要]目的： 研究蛇床子素對轉染APP595/596基因的SH-SY5Y細胞的作用，以探討其可能的作用機制。方法: 體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，并轉染APP595/596基因，體外構建研究Aβ致病作用的細胞模型。采用CCK-8法檢測細胞存活率；檢測LDH評價細胞的損傷程度；流式細胞術檢測細胞凋亡；用RT-PCR和Western blot法檢測β-分泌酶(又稱β位點APP裂解酶1，β-site APP cleaving enzyme 1，BACE 1)的mRNA及蛋白的表達；采用免疫熒光細胞化學和Western blot法檢測Aβ的表達。結果: 蛇床子素對轉染APP595/596基因的SH-SY5Y神經(jīng)細胞有保護作用，可增加細胞的存活率，降低LDH的釋放，抑制細胞的凋亡，減少BACE1的mRNA與蛋白的表達，抑制Aβ的生成。結論: 蛇床子素可保護轉染APP595/596基因的SH-SY5Y神經(jīng)細胞，其保護機制可能與減少BACE l的mRNA與蛋白表達有關。

[關鍵詞]蛇床子素； APP595/596基因； β位點APP裂解酶1

[中圖分類號]R329.2+5; R363[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.021

[文章編號]1000-4718(2015)11-2059-06

[收稿日期]2015-04-13[修回日期] 2015-08-28

[基金項目]*國家自然科學基金資助項目(No. 81260241)

通訊作者△Tel: 0453-7916015; E-mail: 1257067540@qq.com

Protective effect of osthole on SH-SY5Y cells transfected withAPP595/596 geneJIAO Ya-nan, YAO Ying-jia, KONG Liang, LI Shao-heng, TAO Zhen-yu, YAN Yu-hui, YANG Jing-xian

(LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Dalian116600,China.E-mail:jingxianyang@yahoo.com)

ABSTRACT[]AIM: To explore the protective effect of osthole on the SH-SY5Y cells transfected with APP595/596 gene, and to investigate the molecular mechanism. METHODS: The SH-SY5Y cells were transfected with APP595/596 gene in vitro for establishing a cell model to study the pathogenic role of amyloid β-protein (Aβ). The cell viability was detected by CCK-8 assay. The release of lactate dehydrogenase (LDH) was determined by the colour reaction of diaphorase-INT. The cell apoptotic rate was analyzed by flow cytometry. The expression of β-site APP cleaving enzyme 1 (BACE1) at mRNA and protein levels was detected by RT-PCR and Western blot. The expression of Aβ was measured by the technique of immunofluorescence cytochemistry and Western blot. RESULTS: Treatment with osthole inhibited the LDH release, and increased the viability of the cells. The percentage of apoptotic cells was also significantly decreased. Osthole also inhibited the expression of BACE1 at mRNA and protein levels and the protein expression of Aβ. CONCLUSION: Osthole has protective effect on SH-SY5Y cells transfected with APP595/596 gene. The mechanism may be association with inhibiting the mRNA and protein expression of BACE1.

[KEY WORDS]Osthole;APP595/596 gene; β-site APP cleaving enzyme 1

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見的致死性神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于65歲以上的老人，是威脅人類健康和發(fā)展的最嚴峻的社會問題之一。然而卻沒有較好的治療方案，所以找到有效治療AD的藥物對臨床治療AD，提高患者生存率有重要意義。AD的顯著特征是淀粉樣β-蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的沉積[1]。越來越多的研究顯示Aβ是AD形成與發(fā)展的關鍵因素，Aβ的異常聚集和沉積具有神經(jīng)毒性[2]，可引起神經(jīng)細胞的凋亡，促進了AD的發(fā)生[3-4]。

蛇床子素(osthole)又名甲氧基歐芹素，是從多種傘形科植物如中藥蛇床子、獨活等提取分離出來的天然香豆素類化合物[5-6]。目前國內外研究表明蛇床子素有多種藥理作用，包括抗炎、抗腫瘤、抗癌[7]、改善記憶等功效。本實驗利用第595和596位氨基酸密碼子發(fā)生并列突變(G→T和A→C)的淀粉樣前體蛋白595/596(amyloid precursor protein 595/596，APP595/596)基因轉染SH-SY5Y細胞，旨在探究蛇床子素對轉染細胞的神經(jīng)保護作用，進而探討AD發(fā)病的機制及治療方法。

材料和方法

1材料和儀器

SH-SY5Y細胞購于首都醫(yī)科大學；DMEM/F12培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶-EDTA消化液和青霉素/鏈霉素(penicillin and streptomycin，P/S)購于Gibco； APP595/596質粒、GFP質粒DNA以及慢病毒包裝系統(tǒng)pLP1、pLP2、pLP/VSV-G(ViraPowerTMLentiviral Expression Systems)委托天津醫(yī)科大學閆亞平教授前期構建；LipofectamineTM2000 購于Invitrogen；293T細胞由天津醫(yī)科大學閆亞平教授惠贈；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞和無內毒素質粒小提試劑盒購于Omega；蛇床子素購自中國藥品生物制品鑒定所(分子量244.29，純度>99.0%)；細胞增殖與活性檢測試劑盒CCK-8購于Dojindo；Annexin V-Light 650/PI細胞凋亡試劑盒購于沈陽萬類生物公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO) 購于Amresco；LDH試劑盒購于南京建成公司；TRIzol購于Invitrogen；cDNA合成試劑盒和PCR Master Mix試劑均購于Fermentas；兔抗人Aβ1-42單克隆抗體(I 抗)購于Bioss；Cy3 標記羊抗兔免疫球蛋白G(IgG II 抗)購于Jackson；其它試劑皆為國產(chǎn)分析純。

熒光生物顯微鏡(Nikon)；超低溫冰箱(青島海爾)；CO2培養(yǎng)箱(NUAIRE)；酶標儀(深圳邁瑞)；流式細胞儀(BD)；紫外-可見光分光光度計(上海元析)；PCR儀(杭州朗基)；凝膠成像系統(tǒng)(UVP)。

2方法

2.1SH-SY5Y細胞與293細胞的培養(yǎng)SH-SY5Y細胞與293細胞分別常規(guī)培養(yǎng)于DMEM/F12與高糖DMEM完全培養(yǎng)基(10% FBS、1% P/S)中，于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換1次液，待細胞達到80%～90%融合度時進行傳代，選取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.2慢病毒包裝轉染SH-SY5Y細胞建立AD的細胞模型將APP595/596質粒轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，并接種在Ampr抗性平板上，16 h后挑取陽性克隆，置于LB 液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，采用無內毒素質粒小提試劑盒進行提取質粒，再將APP595/596質粒/GFP質粒與慢病毒系統(tǒng)pLP1、pLP2、pLP/VSV-G以15 μg：6.5 μg：2.5 μg：3.5 μg比例用Lipofectamine 2000介導轉染293T包裝細胞，對照組轉染GFP[8]。培養(yǎng)293T細胞，24 h后熒光顯微鏡下觀察2組細胞都呈現(xiàn)綠色熒光。分別收集轉染后72 h的上述293T細胞培養(yǎng)液上清(含病毒)，3 000 r/min離心20 min去除細胞碎片，0.22 μm濾膜過濾除菌，100 kD超濾管5 000 r/min離心1 h得到濃縮液并檢測病毒滴度；用濃縮的病毒上清轉染SH-SY5Y細胞；轉染3 d后用RT-PCR與Western blot檢測APP的 mRNA及蛋白的表達量[9]。

2.3細胞分組對照組為穩(wěn)定轉染GFP的SH-SY5Y細胞；模型組為穩(wěn)定轉染APP595/596基因的SH-SY5Y細胞。給藥組將APP595/596基因穩(wěn)定轉染的SH-SY5Y細胞分別給予終濃度10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的蛇床子素處理24 h后進行實驗。

2.4CCK-8法檢測細胞活力將細胞以1×108/L的密度接種于96孔板中，按上述分組每組3個復孔，培養(yǎng)終點時每孔加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育4 h。用酶標儀在450 nm處檢測吸光度(A)值。

2.5乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放量的檢測細胞以1×108/L接種于96孔板，進行分組，每組取3復孔，培養(yǎng)至終點取上清液，根據(jù)試劑盒說明書進行操作，用紫外-可見光分光光度計于510 nm下測定吸光度值，檢測各組細胞LDH釋放量[10]。

2.6流式細胞術檢測細胞凋亡細胞接種于6孔板，分組處理后，用不含EDTA的胰酶消化，PBS清洗2遍后，加入500 μL的binding buffer重懸細胞；加入5 μL Annexin V-Light 650混勻后，加入5 μL PI混勻，室溫避光反應15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率[11]。

2.7RT-PCR實驗細胞接種于6孔板內，分組后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3次，向每孔加入1 mL的 TRIzol，吹打數(shù)次，轉移到Eppendorf管中，冰浴5 min，再加入0.2 mL氯仿，蓋緊后劇烈振搖15 s，冰浴5 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min；取上層水相，加入0.5 mL異丙醇，輕微混合，冰浴10 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min；棄去上清，用75%乙醇混懸，再7 500 r/min、4 ℃離心5 min；棄去上清將沉淀自然風干后溶于0.01% DEPC水，吹打，提取出總RNA。用紫外分光光度計檢測260 nm和280 nm處吸光度,A260/A280在1.8～2.0范圍內樣品質量合格;濃度=A260×稀釋倍數(shù)×40 mg/L。逆轉錄合成cDNA(25 μL體系)： 取各組RNA 3 μg樣品，按Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit所示比例配制成RT反應體系，65 ℃ 5 min；42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。合成cDNA，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。進行PCR反應(50 μL體系)：按PCR Master Mix Kit所示比例配制成PCR反應體系，樣品DNA取2.5 μL。各引物序列見表 1。反應條件:95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min, 35個循環(huán)，再進行瓊脂糖凝膠電泳，用ImageJ進行光密度掃描分析。

表1　APP、BACE1和β-actin的引物序列

F: forward; R: reverse.

2.8免疫熒光細胞化學法檢測Aβ的表達將細胞接種于96孔板中，每組取3復孔，以4%多聚甲醛固定30 min，再用0.1% Triton X-100透化20 min，加入 I 抗(1∶100)，于4 ℃過夜，次日用PBS洗后，加入Cy3標記特異 II 抗(1∶200)，室溫放置1 h后再用PBS洗滌后，加入DAPI染色15 min后，PBS洗滌后，用倒置熒光顯微鏡觀察并用ImageJ軟件對各組細胞中Aβ的熒光強度進行掃描和定量，平行獨立實驗3次。

2.9Western blot 檢測β位點APP裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme 1, BACE1)及Aβ蛋白的表達細胞裂解液提取總蛋白，蛋白變性，SDS-PAGE分離蛋白，轉膜和封閉。分別與兔抗人BACE1抗體(1∶200)、兔抗人Aβ抗體(1∶200)和羊抗兔過氧化物酶標記 II抗(1∶500)作用?；瘜W發(fā)光劑反應，X線片曝光，顯影，定影。進行掃描分析。

3統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 5軟件完成實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用雙側t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,而后用Bonferroni校正的t檢驗進行多組均數(shù)間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1獲得轉染APP595/596基因穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞

SH-SY5Y細胞轉染APP595/596基因后，可在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況，用RT-PCR法與Western bolt檢測APP的表達情況，結果顯示模型組與對照組相對比APP呈高表達，證明成功獲得穩(wěn)定表達APP的SH-SY5Y細胞，見圖1。

Figure 1. APP was highly expressed inAPP595/596-transfected SH-SY5Y cells. The scale bar=25 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGFP group.

圖1APP在SH-SY5Y細胞中高表達

2蛇床子素對轉染APP595/596基因的SH-SY5Y細胞的保護作用

CCK-8法檢測結果顯示，與對照組相比，轉染APP595/596基因的模型組細胞存活率顯著下降(P<0.01)，而不同濃度的蛇床子素可使得細胞活力上升，其中經(jīng)50 μmol/L蛇床子素處理的細胞活力最高。上述結果顯示50 μmol/L蛇床子素為保護轉染APP595/596基因的SH-SY5Y細胞的最佳濃度。故以下各項實驗中給藥組所用的蛇床子素濃度均為50 μmol/L，見圖2。

3蛇床子素對轉染APP595/596基因的SH-SY5Y細胞中LDH釋放量的影響

模型組細胞的LDH釋放量明顯增加，其釋放量幾近對照組的2倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組相比，給藥組細胞的LDH釋放量明顯減少 (P<0.01)，見圖2。

4蛇床子素抑制轉染APP595/596基因的SH-SY5Y細胞凋亡

流式細胞術結果顯示，模型組凋亡細胞的百分比為27.9%，與對照組的5.2% 相比差異有統(tǒng)計學意義；而給藥組的凋亡細胞百分比為16.4%，顯著低于模型組，說明蛇床子素能有效抑制轉染APP595/596基因的SH-SY5Y細胞的凋亡，見圖2。

Figure 2.The effect of osthole (Ost, 50 μmol/L) on the SH-SY5Y cells transfected withAPP595/596 gene. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGFP group;##P<0.01vsAPP group.

圖2蛇床子素對轉染APP595/596基因的SH-SY5Y細胞的作用

5蛇床子素下調轉染APP595/596基因的SH-SY5Y細胞的Aβ表達

Aβ免疫熒光細胞化學法檢測結果可見，各組細胞漿中均有Aβ的表達，而模型組細胞的紅色熒光強度較對照組明顯減弱，給予蛇床子素后可顯著減弱模型組細胞的熒光強度。Western blot的結果也可見模型組細胞中Aβ蛋白的表達量明顯高于對照組，而給藥組則可顯著降低其表達量，說明蛇床子素可顯著抑制Aβ蛋白的表達水平，見圖3。

6蛇床子素可抑制轉染APP595/596基因的SH-SY5Y細胞中BACE1的 mRNA與蛋白表達

RT-PCR結果顯示，模型組細胞BACE1的mRNA表達量顯著上升，給予蛇床子素后BACE1的mRNA表達量降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明蛇床子素可抑制BACE1的mRNA表達。Western blot法的檢測結果可見，模型組細胞BACE1蛋白表達量與對照組細胞相比顯著上升，給藥組可降低BACE1蛋白的的表達，說明蛇床子素能抑制BACE1蛋白的表達，見圖4。

討論

阿爾茨海默病是嚴重威脅人類晚年生活質量的主要疾病之一，其淀粉樣致病假說已被廣泛接受，研究人員認為Aβ的異常聚集和沉積是AD患者腦內病變的重要原因之一，其腦內水平升高可引起神經(jīng)毒性，包括直接毒性作用和增強、放大各種傷害性毒性作用[12]，進而誘導神經(jīng)細胞的凋亡，最終導致AD的發(fā)生?，F(xiàn)而今已有不少治療AD的方式開始研究，但是目前仍缺乏有效的防治措施。

Figure 3.Osthole (Ost, 50 μmol/L) inhibited Aβ levels inAPP595/596-transfected SH-SY5Y cells(×40). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGFP group;##P<0.01vsAPP group.

圖3蛇床子素可抑制轉染APP595/596基因的SH-SY5Y細胞中Aβ的表達

蛇床子素是獨活、蛇床子等中藥中的活性成分，為天然香豆素衍生物，作為一種脂溶性物質，解離度小，易通過血腦屏障，幾乎沒有毒性作用。已有研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素能通過調控MAPK蛋白表達對大鼠皮層神經(jīng)元內氧和葡萄糖剝奪有作用[13]，更有研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素能改善大鼠記憶功能[14]。這些研究都提示蛇床子素可能具有治療和改善AD相關的臨床癥狀及病理變化的潛在功效。

1992年Citron等[15]發(fā)現(xiàn)APP基因的第595和第596位氨基酸密碼子發(fā)生并列突變(G-T、A-C)，致使Aβ的分泌量顯著升高。因此本實驗采用APP595/596基因轉染SH-SY5Y細胞成功在體外構建研究Aβ致病作用的細胞模型，Aβ的表達顯著升高，SH-SY5Y細胞呈現(xiàn)與Aβ?lián)p傷有關的特征：CCK-8法顯示細胞的存活率降低，LDH表達量增多，流式細胞術結果發(fā)現(xiàn)細胞凋亡率升高。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)給予蛇床子素后對以上損傷變化具有顯著改善。為了進一步研究蛇床子素對神經(jīng)細胞保護作用的機制，本實驗又針對Aβ形成途徑進行研究。采用RT-PCR法與Western blot法，檢測BACE1的mRNA與蛋白的表達。BACE 1是一種膜結合的天冬氨酸蛋白酶，是裂解APP產(chǎn)生Aβ的限速酶，更有研究人員發(fā)現(xiàn)在體內敲除BACE1基因的小鼠，其Aβ的產(chǎn)生會減少[16]，為BACE1作為AD治療靶點的可能性提供了實驗依據(jù)。而本實驗發(fā)現(xiàn)蛇床子素可降低BACE1的 mRNA及蛋白水平，說明蛇床子素可作為BACE1抑制劑，能減少APP的淀粉樣代謝途徑，進而抑制了Aβ蛋白的表達，而關于蛇床子素抑制BACE1的機制，仍需要在今后的研究中做進一步探討。

綜上所述，蛇床子素具有神經(jīng)保護作用，能通過減少BACE1表達進而抑制Aβ的產(chǎn)生，提高細胞的存活率，降低損傷程度，減少細胞凋亡，在治療AD相關新藥的開發(fā)中具有重要的應用價值。

Figure 4.Osthole (Ost, 50 μmol/L) decreased the expression of BACE1 at mRNA and protein levels in the SH-SY5Y cells transfected withAPP595/596. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsGFP group;##P<0.01vsAPP group.

圖4蛇床子素能降低轉染APP595/596的SH-SY5Y細胞中BACE1的mRNA和蛋白表達

[參考文獻]

[1]Kukreja L, Kujoth GC, Prolla TA, et al. Increased mtDNA mutations with aging promotes amyloid accumulation and brain atrophy in the APP/Ld transgenic mouse model of Alzheimer’s disease[J]. Mol Neurodegener, 2014, 9:16.

[2]Kowall NW, Beal MF, Busciglio J, et al. Aninvivomodel for the neurodegenerative effects of β-amyloid and protection by substance P[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991, 88(16):7247-7251.

[3]Butterfield DA. Amyloid β-peptide (1-42)-induced oxidative stress and neurotoxicity: implications for neurodegeneration in Alzheimer’s disease brain. A review[J]. Free Radical Res, 2002, 36(12):1307-1313.

[4]Zhu X, Chen C, Ye D, et al. Diammonium glycyrrhi-zinate upregulates PGC-1α and protects against Aβ1-42-induced neurotoxicity[J]. PLoS One, 2012,7(4):e35823.

[5]周則衛(wèi)，沈秀. 蛇床子素藥理活性的研究概況[J]. 中國新藥雜志, 2006, 15(20):1726-1730.

[6]毛佳蕾，錢曉萍，劉寶瑞. 蛇床子素的提取及其體外抗腫瘤活性的研究進展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學, 2014, 22(3):726-728.

[7]Lin YC, Lin JC, Hung CM, et al. Osthole inhibits insulin-like growth factor-1-induced epithelial to mesenchymal transition via the inhibition of PI3K/Akt signaling pathway in human brain cancer cells[J]. Agric Food Chem, 2014, 62(22):5061-5071.

[8]Yan Y, Ding X, Li K, et al. CNS-specific therapy for ongoing EAE by silencing IL-17 pathway in astrocytes[J]. Mol Ther, 2012, 20(7):1338-1348.

[9]Yang J, Yan Y, Xia Y, et al. Neurotrophin 3 transduction augments remyelinating and immunomodulatory capacity of neural stem cells[J]. Mol Ther, 2014, 22(2):440-450.

[10]Cao BY, Yang YP, Luo WF, et al. Paeoniflorin, a potent natural compound, protects PC12 cells from MPP+and acidic damage via autophagic pathway[J]. J Ethnopharmacol, 2010, 131(1):122-129.

[11]王夢瑤, 王蘇美, 左應林, 等. 姜黃素衍生物 T83 對同源不同輻射抗性鼻咽癌細胞凋亡的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(4): 654-659.

[12]劉洪玲，郭素，王輝明，等. ?？奠`復方對Aβ(1-40)誘導SH-SY5Y細胞損傷的保護作用[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志,2013, 33(17):1405-1408.

[13]Chen T, Liu W, Chao X, et al. Neuroprotective effect of osthole against oxygen and glucose deprivation in rat cortical neurons: involvement of 49 mitogen-activated protein kinase pathway[J]. Neuroscience, 2011, 183(6):203-211.

[14]沈麗霞，張丹參，張力，等. 蛇床子素對學習記憶的影響及其機制分析[J]. 藥學學報，1999, 34(6):405-409.

[15]Citron M, Oltersdorf T, Haass C, et al. Mutation of the β-amyloid precursor protein in familial Alzheimer’s disease increases β-protein production[J]. Nature, 1992, 360(6405):672-674.

[16]謝兆宏. 長非編碼RNA通過調節(jié)BACE1表達介導β淀粉樣蛋白生成的機制研究[D]. 濟南：山東大學, 2012.

(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)