·論著·

人C型凝集素受體dectin-1單克隆抗體的制備

楊龍1，王英2，朱樂樂3，姜遠(yuǎn)英1*，賈鑫明3*

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院皮膚科，上海 200433；3.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，上海 200092)

[摘要]目的：克隆獲得并原核表達(dá)人dectin-1基因的胞外段，以其作為抗原，制備人C型凝集素受體dectin-1的單克隆抗體。方法和結(jié)果：利用RT-PCR技術(shù)從人的外周血中克隆獲得人dectin-1基因，克隆到pCDNA 3.0(+)載體中，獲得pCDNA3.0(+)-dectin-1質(zhì)粒。將dectin-1胞外段[dectin-1 (202 bp-744 bp)]克隆到pET28a(+)載體，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)，轉(zhuǎn)到大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)中，IPTG誘導(dǎo)目的片段原核表達(dá)，得到高效表達(dá)的dectin-1(202 bp-744 bp)，鎳柱親和層析純化后免疫BALB/c小鼠，取抗體滴度高的小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，獲得15株陽性雜交瘤細(xì)胞株，利用有限稀釋法進(jìn)行單克隆雜交瘤細(xì)胞株的篩選，獲得5株單克隆細(xì)胞株。用單克隆細(xì)胞株制備小鼠腹水模型，經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法純化獲得dectin-1的單克隆抗體。經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證，此單克隆抗體能有效地識(shí)別人和小鼠的dectin-1蛋白。結(jié)論：成功制備獲得dectin-1蛋白的特異、高效的單克隆抗體。

[關(guān)鍵詞]C型凝集素受體；dectin-1；單克隆抗體

[中圖分類號(hào)]R392.5，R967[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI：10.5428/pcar20150204

基金項(xiàng)目上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研基金(12JC1408400)

作者簡介楊龍(男)，碩士生.

[收稿日期]2014-05-05

Preparation of monoclonal antibody of human C-type lectin receptors dectin-1

YANG Long1，WANG Ying2，ZHU LeLe3，JIANG YuanYing1*，JIA XinMing3*(1.New Drug Reseach and Development Center，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433,China；2. Department of Dermatology，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；3. Department of Immunology，School of Medicine，Tongji University，Shanghai 200092,China)

ABSTRACT[]Objective：To clone and prokaryoticly express the extracellular region of human C-type lectin receptor dectin-1 and prepare monoclonal antibodies of human dectin-1. Methods and Results：The full-length human dectin-1 mRNA was cloned from peripheral blood monocytes by using RT-PCR and inserted into the pCDNA3.0(+) vector. The extracellular region of dectin-1[dectin-1 (202 bp-744 bp)] was cloned and inserted into pET28a(+) vector to get pET28a(+)-dectin-1 (202 bp-744 bp) vector. The recombinant pET28a-dectin-1 (202 bp-744 bp) vector was transformed into E.coli BL21 (DE3). The expression of objective protein was high when induced with IPTG. The objective protein was purified with Ni-NTA affinity chromatograph and was used to immunize BALB/c mice. The mice which generated higher titer of antibody in the serum were sacrificed.The splenocytes were separated and fused with SP2/0 cells to generate hybridoma cells. Fifteen strains of hybridoma cells were thus obtained. After further selection and cloning，5 strains of monoclonal hybridoma cells secreting monoclonal antibodies against dectin-1 were established. BALB/c mice was intraperitoneally injected into hybridoma cells to produce ascites. The dectin-1 monoclonal antibody was purified by standard protocol of octanoic acid-ammonium sulfate precipitation，which could specifically combine to dectin-1，no matter whether they were human dectin-1 or mouse dectin-1,when used in Western blotting. Conclusion：The specific monoclonal antibodies against dectin-1 were successfully obtained.

[KEY WORDS]C-type lectin receptor;dectin-1;monoclonal antibody

[Pharm Care Res，2015，15(2)：95-98,146]

E-mail：muyi53@163.com

*通信作者(Corresponding author)：姜遠(yuǎn)英，E-mail：jiangyy@smmu.edu.cn；賈鑫明，E-mail：jiaxm@#edu.cn

C 型凝集素受體(C-type lectin receptor，CLR)是一類重要的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)，主要配體是糖成分。由于真菌細(xì)胞壁中含有大量的糖，所以CLR在抗真菌免疫中發(fā)揮重要作用[1]。Dectin-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1)屬于CLR超家族中的dectin-1亞家族，是研究最為廣泛的一種C型凝集素受體，在抗真菌固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[2]。Dectin-1基因位于人12號(hào)染色體(小鼠6號(hào)染色體)NKC(natural killer-gene complex)的端粒區(qū)[3]，其基因結(jié)構(gòu)在人和小鼠中高度保守，氨基酸同源性為73.9%。Dectin-1主要表達(dá)在樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞表面，dectin-1為Ⅱ型糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包括胞質(zhì)區(qū)免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recognization domain，CRD)[4]。Dectin-1結(jié)合白念珠菌細(xì)胞壁分子β-glucan后，通過激活胞內(nèi)的ITAM，募集激活Syk激酶，誘導(dǎo)CARD9/Bcl10/MALT1形成復(fù)合體，進(jìn)而激活NF-κB，表達(dá)TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子，啟動(dòng)機(jī)體的抗真菌感染固有免疫應(yīng)答，并介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[5-8]。本研究通過克隆dectin-1胞外區(qū)序列并進(jìn)行原核表達(dá)，以純化的dectin-1胞外段蛋白為抗原免疫小鼠，篩選獲得特異性分泌dectin-1抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞，制備功能性的抗dectin-1的單克隆抗體，為進(jìn)一步研究dectin-1的生物學(xué)功能提供有效的工具。

1材料

1.1細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心實(shí)驗(yàn)室保存；6周齡BALB/c小鼠購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002；質(zhì)粒 pET28a (+)、pCDNA3.0及菌株E.coliDH5α與E.coliBL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑和器材RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、丙酮酸鈉、青霉素、鏈霉素、卡那霉素、trizol等，均購自Life Technologies公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT、聚乙二醇(PEG)等均購自Sigma公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京康為世紀(jì)公司；高結(jié)合力酶標(biāo)板購自Novagen公司；Galaxy 170 S CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國Eppendorf公司；iMARK多功能酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司。PCR引物(見表1)由鉑尚公司合成。

2方法和結(jié)果

2.1pCDNA3.0(+)-dectin-1和pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定利用trizol方法抽提人外周血RNA，按照Promega公司的RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟將抽提的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以其為模板利用PCR技術(shù)擴(kuò)增(擴(kuò)增條件為：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存)，獲得人全長的dectin-1基因，見圖1A。用BamHⅠ和XholⅠ雙酶切上述的dectin-1 基因和載體質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，T4 DNA連接酶連接獲得dectin-1-pcDNA3.1(+)質(zhì)粒。再以pCDNA 3.0(+)-dectin-1質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，獲得dectin-1基因胞外段[dectin-1(202 bp-744 bp)]，見圖1B。用BamHⅠ和XholⅠ雙酶切上述dectin-1(202 bp-744 bp)和載體質(zhì)粒 pET28a(+)；T4 DNA連接酶連接，獲得pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)質(zhì)粒，見圖1C。挑取單克隆進(jìn)行酶切鑒定及測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與PubMed中的dectin-1基因(Gene ID:64581，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/64581)的序列完全相同，表明將dectin-1(202 bp-744 bp)成功克隆到pET28a(+)質(zhì)粒中。

表1　引物列表

注：下劃線表示酶切位點(diǎn)

圖1　人dectin-1，dectin-1(202 bp-744 bp)及pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)質(zhì)粒 Figure 1　Human dectin-1，dectin-1 (202 bp-744 bp) and pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp) plasmids A：dectin-1；B：dectin-1 (202 bp-744 bp)，M：Marker，1：dectin-1 (202 bp-744 bp)；C：pET28a(+)-dectin-1 (202 bp-744 bp)，M：Marker，1-9：9個(gè)不同的pET28a(+)-dectin-1 (202 bp-744 bp)

2.2Dectin-1胞外段蛋白的原核表達(dá)和純化將經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒pET28a(+) -dectin-1(202 bp-744 bp)轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，取陽性單克隆接種于5 ml含卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜；次日取2 ml上述菌液于40 ml新鮮LB中培養(yǎng)，加入終濃度為0.3 mmol/L的異丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)，26 ℃誘導(dǎo)10 h，4 ℃，15 805×g離心3 min。收集細(xì)菌，用PBS洗滌3次，再重懸于10 ml PBS中，超聲波裂解，10 976×g離心30 min。取80 μl上清液與20 μl的5×loading buffer，混勻，100 ℃金屬浴5 min；同時(shí)向沉淀中加入5 ml PBS(含6 mol/L尿素)，混勻，3951×g離心5 min后取80 μl上清液與20 μl的5×loading buffer混勻，100 ℃金屬浴5 min。分別將收集的上清液和沉淀的樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色和脫色，結(jié)果顯示目的片段[dectin-1 (202 bp-744 bp)]約17 ku，目的條帶主要在沉淀部分，說明以包涵體形式表達(dá)(圖2A-5)。取沉淀變性，用Ni-NTA His親和層析柱純化后復(fù)性，將獲得組分進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)，顯示獲得高純度蛋白(圖2B)。

圖2　Dectin-1胞外段重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 及純化的SDS-PAGE電泳圖 Figure 2　SDS-PAGE electrophorograms of expression products and purified dectin-1 recombinant extracellular region protein A：Dectin-1胞外段重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE電泳圖；B：Dectin-1胞外段重組蛋白純化后SDS-PAGE電泳圖；M：Marker；1：沒有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的E.coli BL21；2：轉(zhuǎn)化pET28a(+)-dectin-1(202 bp- 744 bp)質(zhì)粒的E.coli BL21；3：0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h的E. coli BL21；4：0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo) 10 h E.coli BL21 上清液； 5：0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)10 h E.coli BL21沉淀； 6：純化后的 dectin-1胞外段蛋白；IPTG：異丙基-β-D-半乳糖苷

2.3小鼠免疫和血清抗體滴度的測(cè)定取6周齡BALB/c小鼠3只，皮下注射純化后的抗原蛋白50 μg/只(根據(jù)蛋白質(zhì)濃度不同，體積不同)與等體積弗氏完全佐劑混勻的乳化物免疫小鼠；間隔2周后，皮下注射抗原蛋白(50 μg/只)與等體積弗氏不完全佐劑混勻的乳化物免疫小鼠，共5次(間隔均是2周)。最后1次免疫后第10天(d 10)測(cè)定小鼠血清抗體滴度。小鼠尾部取血，4 ℃靜置過夜，1756×g離心10 min。收集上清液，并做1/500、1/1000、1/2000、1/4000、1/8000、1/16 000、1/32 000、1/64 000梯度稀釋。各取100 μl加入酶標(biāo)板中，4 ℃孵育過夜；PBST洗板后加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(1∶5000稀釋)，37 ℃孵育1 h；洗滌后加入TMB顯色液，顯色至適當(dāng)顏色后用終止液進(jìn)行終止反應(yīng)，并用酶標(biāo)儀在450 nm波長處讀取吸光度值。

如圖3A所示，2號(hào)小鼠血清中抗體效價(jià)較高。用3只小鼠的血清檢測(cè)抗原蛋白，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，3只小鼠血清都可特異性地結(jié)合抗原蛋白，2號(hào)和3號(hào)小鼠血清結(jié)合較好(圖3B)。故選擇2號(hào)小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 按5∶1的比例進(jìn)行融合，建立雜交瘤細(xì)胞株。

圖3　Dectin-1免疫小鼠血清抗體測(cè)定 Figure 3　Identification of dectin-1 antibodies (mouse serum) activity A：Elisa法檢測(cè)dectin-1血清抗體滴度；B：蛋白質(zhì)印跡法 檢測(cè)dectin-1血清抗體的結(jié)合活性； ○：m1； ●：m2； △：m3

2.4Dectin-1雜交瘤細(xì)胞單克隆的篩選、鑒定選擇免疫效果最好的2號(hào)小鼠做雜交瘤融合。最后一次免疫2周后，2號(hào)小鼠腹腔注射抗原蛋白50 μg(不加佐劑)，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。腹腔注射后d 4摘眼球取血，處死動(dòng)物，取脾臟，分離脾細(xì)胞，按照常規(guī)操作步驟將脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0融合。用HAT選擇性培養(yǎng)基對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行篩選，建立雜交瘤細(xì)胞株，并用間接Elisa法檢測(cè)細(xì)胞上清液中抗體效價(jià)，將強(qiáng)陽性細(xì)胞克隆化。隨后用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆篩選，若一個(gè)單克隆連續(xù)2～3次亞克隆，得到的所有克隆均為陽性時(shí)，可認(rèn)定該單克隆細(xì)胞能穩(wěn)定分泌特異性抗體，將該細(xì)胞建株，擴(kuò)增保存或供制備小鼠腹水用。初步篩選結(jié)果如圖4A所示，獲得15株dectin-1陽性雜交瘤細(xì)胞，其中有6株單克隆細(xì)胞上清在450 nm處吸光度值較高，提示具有較高效價(jià)，對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)，結(jié)果顯示有5株單克隆細(xì)胞上清液與抗原蛋白結(jié)合較高(圖4B)。

圖4　分泌dectin-1抗體的雜交瘤細(xì)胞篩選鑒定 Figure 4　Selection of hybridomas secreting dectin-1 antibody A：Elisa法檢測(cè)單克隆雜交瘤細(xì)胞上清液中抗體滴度；B：蛋白質(zhì) 印跡法檢測(cè)5株單克隆雜交瘤細(xì)胞上清液與抗原蛋白的結(jié)合 能力；-：未免疫小鼠血清；+：抗原免疫小鼠陽性血清

2.5小鼠腹水制備、抗體純化、小鼠單克隆抗體的鑒定選取3株單克隆細(xì)胞株制備小鼠腹水。另取6周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 ml 弗氏不完全佐劑免疫，10 d后將經(jīng)篩選能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株以2×105個(gè)/只的量進(jìn)行腹腔注射。腹腔注射雜交瘤細(xì)胞株后14 d抽取腹水，用辛酸-硫酸銨沉淀法純化獲得dectin-1(202 bp-774 bp)的單克隆抗體，4 ℃透析過夜后測(cè)定抗體濃度，并保存待鑒定。

用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)dectin-1抗體的特異性反應(yīng)性。文獻(xiàn)報(bào)道dectin-1參與真菌的識(shí)別，并可以被誘導(dǎo)而致高表達(dá)[9]，故提取1例真菌感染病人單核細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的總蛋白，1例健康志愿者的外周血單核細(xì)胞的總蛋白。蛋白質(zhì)印跡法顯示，3株單克隆抗體都能與人dectin-1蛋白特異性結(jié)合，圖5A-1、圖5A-2、圖5A-3分別顯示3株單克隆抗體與健康人外周單核細(xì)胞總蛋白、真菌感染病人外周單核細(xì)胞、真菌感染病人骨髓細(xì)胞總蛋白特異性結(jié)合，圖5A-2和5A-3的3個(gè)條帶的灰度比圖5A-1的3個(gè)條帶要深，說明dectin-1在真菌感染病人的外周單核細(xì)胞和骨髓細(xì)胞高表達(dá)。由于人dectin-1和小鼠dectin-1的編碼序列有很高的同源性，提取野生型小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)，用白念珠菌刺激小鼠BMDM，30 min后抽提BMDM總蛋白。以3株制備的單克隆抗體為一抗，蛋白質(zhì)印跡法顯示，制備的抗體可以識(shí)別BMDM中的dectin-1蛋白(圖5B)。上述結(jié)果說明制備的3株抗體均可以特異性識(shí)別人和小鼠的dectin-1分子。

圖5　Dectin-1單克隆抗體對(duì)內(nèi)源性 dectin-1的識(shí)別能力檢測(cè) Figure 5　Western blot analysis and detection of natural dectin-1 by dectin-1 monoclonal antibody A：Dectin-1單克隆抗體檢測(cè)人外周血單核細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中dectin-1的表達(dá)；B：Dectin-1單克隆抗體檢測(cè)小鼠BMDM中dectin-1的表達(dá)；1：健康人外周血單核細(xì)胞總蛋白； 2：真菌感染 病人外周血單核細(xì)胞總蛋白；3：真菌感染病人骨髓細(xì)胞總蛋白

3討論

Dectin-1是介導(dǎo)機(jī)體抗真菌感染固有免疫應(yīng)答的重要受體，在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞上高度表達(dá)。研究表明，dectin-1可以識(shí)別白念珠菌酵母態(tài)，啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答效應(yīng)，發(fā)揮抗白念珠菌感染作用[5-8]。

Dectin-1胞外段的CRD主要參與配體的識(shí)別，其在C型凝集素受體家族中高度的保守，dectin-1的胞外段除能識(shí)別β-葡聚糖外，還能識(shí)別T細(xì)胞表面的未知的內(nèi)源性配體，促進(jìn)T細(xì)胞增殖[4]。另有研究表明，dectin-1能夠識(shí)別凋亡細(xì)胞，介導(dǎo)凋亡細(xì)胞的吞噬，表明在凋亡細(xì)胞的表面也有dectin-1能夠識(shí)別的配體[10]。本實(shí)驗(yàn)克隆了包括CRD在內(nèi)的人dectin-1的整個(gè)胞外區(qū)片段，構(gòu)建了pET28a(+)-dectin-1(202 bp-744 bp)質(zhì)粒。該表達(dá)質(zhì)粒在E.coliBL21(DE3)中可高效表達(dá)重組蛋白。利用純化的目的蛋白免疫小鼠來制備抗體，通過一系列的Elisa和抗原蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證，獲得了5株單克隆細(xì)胞株。通過進(jìn)一步的篩選，3株抗體可以識(shí)別小鼠的BMDM以及人的外周血單核細(xì)胞中的dectin-1分子。研究表明，在真菌感染過程中，dectin-1可以被誘導(dǎo)高表達(dá)[9]，用3株制備的抗體檢測(cè)真菌感染病人的外周血單核細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的總蛋白，發(fā)現(xiàn)3株抗體都能有效地檢測(cè)到dectin-1表達(dá)的上升。提示制備抗體可以用于檢測(cè)真菌感染病人

及其愈后。對(duì)于dectin-1等C型凝集素受體的深入研究將有助于對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)維持的深入認(rèn)識(shí)，從而對(duì)真菌感染和自身免疫性疾病的治療、疫苗的研制，以及新藥的研發(fā)等起指導(dǎo)作用。而dectin-1特異性抗體的成功制備，對(duì)于深入研究dectin-1在抗真菌免疫中的作用有很大幫助。

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[修回日期]2015-03-15

[本文編輯]貢沁燕