■周 凱 徐 慧 劉建軍，

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部，山東濟(jì)南250353；2.山東省食品發(fā)酵工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250013）

白酒酒糟是白酒發(fā)酵的主要廢棄物。酒糟中含有大量氨基酸、脂肪及多種微量元素等營(yíng)養(yǎng)[1]成分，可以代替主糧添加進(jìn)飼料[2-5]，達(dá)到緩解人畜爭(zhēng)糧矛盾[6]的目的。酒糟添加進(jìn)飼料可以降低飼料成本[7]、提高酒廠利潤(rùn)。但添加酒糟的飼料含有大量的木聚糖、甘露聚糖、大分子蛋白質(zhì)、植酸以及退化淀粉等抗?fàn)I養(yǎng)因子。為降解這些抗?fàn)I養(yǎng)因子，大量產(chǎn)消化酶益生菌[8]被運(yùn)用于飼料生產(chǎn)中，多酶益生菌飼料[9]應(yīng)運(yùn)而生。多酶益生菌飼料是采用微生物發(fā)酵的方法對(duì)飼料底料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、易被消化吸收、富含多種消化酶且兼具有一定的益生特性[10]的飼料。在多酶益生菌飼料制備過程中，菌種的選擇至關(guān)重要。利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵生產(chǎn)的飼料具有富含多種消化酶、安全無毒等特性[11-12]。飼料中添加乳酸菌（Lacticacid bacteria）則可以改善飼料風(fēng)味，提高飼料適口性[13]。除此之外，枯草芽孢桿菌與乳酸菌互利共生，共同培養(yǎng)可以有效抑制大腸桿菌等好氧致病菌的生長(zhǎng)繁殖[14]。因此，目前大多數(shù)多酶益生菌飼料均采用枯草芽孢桿菌和乳酸菌作為發(fā)酵菌種。

試驗(yàn)選擇實(shí)驗(yàn)室保藏的產(chǎn)木聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶、蛋白酶、淀粉酶的枯草芽孢桿菌和乳酸片球菌對(duì)添加白酒酒糟的飼料底料進(jìn)行發(fā)酵，制備多酶益生菌飼料。以產(chǎn)酶菌種的活菌數(shù)與酶活在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)[15]為理論依據(jù)，考察多酶益生菌飼料中底物的各組分比例及發(fā)酵條件對(duì)益生菌活菌數(shù)的影響。通過單因素和正交試驗(yàn)探究制備多酶益生菌飼料的工藝，為多酶益生菌飼料的規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

試驗(yàn)選擇產(chǎn)甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌L-1、產(chǎn)植酸酶的枯草芽孢桿菌L-2、產(chǎn)木聚糖酶的枯草芽孢桿菌YB-5，改善飼料風(fēng)味的乳酸片球菌Rp。以上菌種均由實(shí)驗(yàn)室保藏并提供。

1.1.2 原料

白酒酒糟、玉米粉、麩皮、豆粕。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

①乳酸片球菌種子培養(yǎng)基(g/l)：牛肉膏 10、蛋白胨10、酵母粉5、葡萄糖5、醋酸鈉5、檸檬酸二銨2、吐溫80 1，pH值6.5～6.8，37 ℃靜置培養(yǎng)6 h接種。

②枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基（g/l）：蛋白胨10、牛肉膏5、氯化鈉3，pH值7.0，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 h后接種。

③ 平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（g/l）：蛋白胨10、牛肉膏5、酵母粉5、葡萄糖5、醋酸鈉5、檸檬酸二銨2、吐溫80 1、瓊脂條20，pH值6.5，涂布后培養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)。

④ 初始固態(tài)培養(yǎng)基：酒糟400 g、玉米粉250 g、麩皮200 g、豆粕150 g，初始pH值7.0，37 ℃培養(yǎng)72 h，測(cè)定酶活及活菌數(shù)。

以上培養(yǎng)基均在溫度121℃、時(shí)間20 min條件下滅菌。

1.3 試驗(yàn)方法

活化益生菌種產(chǎn)甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌L-1、產(chǎn)植酸酶的枯草芽孢桿菌L-2、產(chǎn)木聚糖酶的枯草芽孢桿菌YB-5、乳酸片球菌Rp。接種順序?yàn)長(zhǎng)-2先接種4 h，再同時(shí)接L-1、YB-5、Rp；L-1、L-2、YB-5、Rp接種比例為1∶1∶2∶4；接種量為15%，37℃下培養(yǎng)84 h，發(fā)酵結(jié)束后取樣檢測(cè)指標(biāo)。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 多酶益生菌飼料活菌數(shù)測(cè)定（平板計(jì)數(shù)）

取發(fā)酵結(jié)束后的多酶益生菌飼料1 g，置于100 ml蒸餾水中，加入玻璃珠振蕩搖勻30 min。進(jìn)行10-1～10-11梯度稀釋，搖勻后以0.2 ml稀釋液涂布計(jì)數(shù)。選擇菌落個(gè)數(shù)在10～300以內(nèi)的平板計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)以同梯度三個(gè)平板菌落平均數(shù)為準(zhǔn)。

1.4.2 酶活測(cè)定

固體樣品測(cè)定時(shí)取發(fā)酵結(jié)束后的多酶益生菌飼料5 g，稀釋到50 ml加玻璃珠振蕩30 min。4 000 r/min離心20 min，以上清液為粗酶液。以不同的方法測(cè)定飼料樣品中的酶活[16]。

液體樣品以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min后取上清液為粗酶液。

測(cè)定甘露聚糖酶酶活采用DNS法[17]；植酸酶酶活測(cè)定采用鉬黃法[18-19]；木聚糖酶活測(cè)定采用DNS法[20]；蛋白酶酶活測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[21]；淀粉酶酶活測(cè)定采用DNS法[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 底料組分對(duì)多酶益生菌飼料中益生菌活菌數(shù)的影響

2.1.1 白酒酒糟含量對(duì)活菌數(shù)的影響(見圖1)

圖1 白酒酒糟含量對(duì)多酶益生菌飼料中活菌數(shù)的影響

白酒酒糟可以豐富多酶益生菌飼料底料中的蛋白種類。除此之外還可以降低底料中的黏性，利于好氧益生菌的生長(zhǎng)繁殖。分別取占發(fā)酵干基底料8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、52%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的白酒酒糟進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后取樣測(cè)定多酶益生菌飼料中的益生菌活菌數(shù)。圖1表明，白酒酒糟含量在35%～45%之間，活菌數(shù)最多。

2.1.2 玉米粉含量對(duì)活菌數(shù)的影響(見圖2)

圖2 玉米粉含量對(duì)多酶益生菌飼料中活菌數(shù)的影響

試驗(yàn)中考察玉米粉含量對(duì)多酶益生菌飼料中活菌數(shù)的影響。如圖2所示，玉米粉占發(fā)酵干基底料質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%～30%時(shí)菌體活菌數(shù)均維持在一個(gè)較高的水平。

2.1.3 麩皮含量對(duì)活菌數(shù)的影響(見圖3)

圖3 麩皮含量對(duì)多酶益生菌飼料中活菌數(shù)的影響

試驗(yàn)中麩皮含量對(duì)活菌數(shù)影響較大。如圖3所示，干基底料中麩皮含量在20%～30%（m/m）之間時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值。

2.1.4 豆粕含量對(duì)活菌數(shù)的影響(見圖4)

圖4 豆粕含量對(duì)多酶益生菌飼料中活菌數(shù)的影響

豆粕在飼料中添加可以豐富飼料中蛋白種類，飼料中豆粕含量的改變會(huì)引起活菌數(shù)的變化。如圖4所示，干基底料中豆粕含量在7%～9%（m/m）范圍內(nèi)活菌數(shù)含量最高。

2.1.5 料水比對(duì)活菌數(shù)的影響(見圖5)

圖5 料水比對(duì)多酶益生菌飼料中活菌數(shù)的影響

多酶益生菌飼料發(fā)酵中水活度對(duì)活菌數(shù)影響較大，當(dāng)飼料中含水量較低時(shí)菌體生長(zhǎng)繁殖受到抑制，活菌數(shù)含量較低。水分含量較高時(shí)，飼料黏性升高，降低溶氧量，導(dǎo)致活菌數(shù)較低，圖5表明，料水比為1∶0.8時(shí)活菌數(shù)取得最大值。

2.1.6 硫酸銨含量對(duì)活菌數(shù)的影響(見圖6)

圖6 硫酸銨含量對(duì)多酶益生菌飼料中活菌數(shù)的影響

試驗(yàn)選擇硫酸銨溶入水中作為多酶益生菌發(fā)酵中的無機(jī)氮源，豐富氮源種類，提高益生菌活菌數(shù)含量。圖6表明，在水中溶解質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%硫酸銨時(shí)活菌數(shù)含量達(dá)到最大值。

2.1.7 尿素含量對(duì)活菌數(shù)的影響(見圖7)

圖7 尿素含量對(duì)多酶益生菌飼料中活菌數(shù)的影響

尿素作為無機(jī)氮源硫酸銨的補(bǔ)充添加進(jìn)飼料當(dāng)中，圖7反映出當(dāng)尿素質(zhì)量占水分質(zhì)量的1.1%時(shí)，活菌數(shù)維持在較高水平。

2.1.8 多酶益生菌飼料組分含量的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇發(fā)酵過程中對(duì)活菌數(shù)對(duì)應(yīng)含量最高的麩皮、料水比、酒糟、豆粕、尿素為因素，設(shè)計(jì)5因素4水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表（見表1）考察多酶益生菌飼料中活菌數(shù)，最終確定多酶益生菌飼料中各組分含量。

2.1.9 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交表L16(45)進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

對(duì)表2進(jìn)行極差分析可以看出，組合A3B2C1D4E3為優(yōu)勢(shì)組合。試驗(yàn)無此組合，故選擇活菌數(shù)最大的A2B2C1D4E3為優(yōu)勢(shì)組合，即麩皮含量在28%，料水比為1∶0.8酒糟含量36%，豆粕含量8%，尿素值為1.1%。因四種固態(tài)底料成分之和為100%，故確定玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%，此時(shí)活菌數(shù)到達(dá)最大值1.8×1011cfu/g。隨后對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（如表3所示）。其中，因素A麩皮含量和因素B底料含水量對(duì)多酶益生菌飼料發(fā)酵中益生菌活菌數(shù)影響最大。

表1 正交因素水平設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

2.2 發(fā)酵條件對(duì)多酶益生菌飼料中益生菌活菌數(shù)的影響

在確定多酶益生菌飼料的底料組分后，繼續(xù)試驗(yàn)考察發(fā)酵時(shí)間、溫度、初始pH值以及固料裝填量對(duì)益生菌活菌數(shù)的影響，確定發(fā)酵條件。

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)的影響（見圖8）

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多酶益生菌飼料中活菌數(shù)的影響

在固態(tài)發(fā)酵過程中，隨著時(shí)間的增加，多酶益生菌飼料中活菌數(shù)逐漸增加，但是隨著時(shí)間的推移，多酶益生菌飼料中益生菌數(shù)逐漸達(dá)到臨界，在此之后活菌數(shù)不再增加。如圖8所示，發(fā)酵進(jìn)行到在84 h時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值。

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)活菌數(shù)的影響（見圖9）

圖9 發(fā)酵溫度對(duì)多酶益生菌飼料中活菌數(shù)的影響

試驗(yàn)過程考察多酶益生菌飼料在不同培養(yǎng)溫度下的活菌數(shù)變化趨勢(shì)，圖9表明，當(dāng)溫度在35～37℃范圍時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值。

2.2.3 初始pH值對(duì)活菌數(shù)的影響（見圖10）

圖10 初始pH值對(duì)多酶益生菌飼料中活菌數(shù)的影響

調(diào)節(jié)多酶益生菌飼料培養(yǎng)基中的初始pH值，發(fā)現(xiàn)初始pH值在6.5～7.5范圍內(nèi)對(duì)活菌數(shù)影響不大，參考圖10數(shù)據(jù)取初始pH值7.0作為發(fā)酵pH值。

2.2.4 裝填量對(duì)活菌數(shù)的影響（見圖11）

圖11 搖瓶裝填量對(duì)多酶益生菌飼料中活菌數(shù)的影響

如圖11所示，在250 ml搖瓶中分別裝填14、16、18、20、22 g固態(tài)發(fā)酵底料，檢測(cè)發(fā)酵結(jié)束后益生菌活菌體的數(shù)量。發(fā)現(xiàn)搖瓶裝填量在20 g/250 ml時(shí)，活菌數(shù)最大。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在單因素結(jié)束后，確定最佳發(fā)酵條件為：初始pH值7.0、溫度37℃、裝填量20 g/250 ml條件下發(fā)酵84 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與小結(jié)

通過單因素及正交試驗(yàn)得到多酶益生菌飼料發(fā)酵生產(chǎn)的最優(yōu)條件為，干基中麩皮含量為28%、白酒酒糟含量36%、玉米粉含量26%、豆粕含量8%；料水比為1∶0.8，水中含有2.0%硫酸銨和1.1%尿素。在初始pH值為7.0、溫度為37℃、裝填量為20 g/250 ml條件下發(fā)酵84 h。測(cè)得該多酶益生菌飼料中益生菌活菌數(shù)為1.97×1011cfu/g、木聚糖酶酶活達(dá)到15.30 U/g、植酸酶酶活16.37 U/g、甘露聚糖酶酶活11.62 U/g、淀粉酶酶活19.37 U/g、蛋白酶酶活15.27 U/g。在最優(yōu)條件下，多酶益生菌飼料各指標(biāo)均有較大幅度的提高，其中麩皮含量與料水比在試驗(yàn)中對(duì)多酶益生菌飼料的活菌數(shù)影響最大。在生產(chǎn)多酶益生菌飼料的同時(shí)，充分利用了白酒酒糟當(dāng)中的營(yíng)養(yǎng)成分，為白酒酒糟的高附加值利用提供了可行的途徑。