北蟲草素對體外小鼠肝癌H22細胞增殖及肝癌鼠血清中IL-2/TNF-α水平的影響

張莉莉1，陳偉2，梁國強2*

(1.蘇州市立醫(yī)院(本部)門診藥房,江蘇 蘇州 215000；2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院 吳門醫(yī)派研究院，江蘇 蘇州 215000)

摘要：目的探討北蟲草素對體外培養(yǎng)的小鼠肝癌H22細胞的增殖和H22荷瘤肝癌小鼠血清中IL-2和TNF-α水平的影響。方法 分別用5，10，20，40，80 mg/L的北蟲草素處理H22細胞48 h后，應用MTT法檢測細胞的增殖抑制率；采用細胞接種的方法建立H22肝癌小鼠動物模型，隨機分成5組，每組8只,雙抗體夾心法(ELISA)檢測小鼠血清IL-2和TNF-α數(shù)值。結(jié)果北蟲草素呈劑量依賴性抑制H22細胞增殖(F=105.333，P<0.001)；環(huán)磷酰胺組、北蟲草素中高劑量組小鼠瘤重顯著低于對照組(P<0.01)，抑瘤率分別為55.60%，32.94%，43.94%。與對照組比較，北蟲草素中高劑量組IL-2及TNF-α在血清中的表達均顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或0.01)。結(jié)論北蟲草素能明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤生長，增強機體的免疫功能。

關(guān)鍵詞：北蟲草素；抗腫瘤；免疫功能；IL-2；TNF-α；小鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.02.027

中圖分類號：R285.5文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)02-0184-03

基金項目:2012年蘇州市“科教興衛(wèi)”青年科技項目(SS1326)。

作者簡介:張莉莉(1976-)，女，大學本科，主管中藥師，主要從事中藥學及中藥成分分析。

收稿日期:(責任編輯：趙玉芝2014-07-03)

*通信作者:梁國強，電話-13584809803，電子信箱-616250366@qq.com

Effects of North Cordyceps on proliferation of hepatoma-22 cells in vitro and IL-2/TNF-α

in serum on Hepatic Cancer Mice

ZHANG Lili1,CHEN Wei2,LIANG Guoqiang2

(1.Outpatient pharmacy,Suzhou Municipal Hospital,Suzhou 215000,Jiangsu Province,China;

2.Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Institute of Wumen Traditional Chinese Medicine,

Suzhou 215000,Jiangsu Province,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of North Cordyceps on proliferation of hepatoma-22 cells in vitro and IL-2/TNF-α in serum on Hepatic Cancer Mice.MethodsMTT was employed to detect proliferation ability of H22 cells treated with 5，10，20，40，80mg/L North Cordyceps for 48 h,respectively,the model of hepatoma-22 Hepatic Cancer Mice were established by the cell inoculation Method,and the animals were randomly divided into 5 groups.8 rats in each group were pick up randomly.The number of IL-2 and TNF-α were detected by Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).ResultsThe proliferation inhibtion rate of North Cordyceps on H22 cells were enhanced in a dose-dependant manner (F=105.333,P<0.001).The inhibiting rate of Cyclophosphamide group,cordycepin in the Middle,high dose group was 55.60%,32.94% and 43.94% by using analysis of variance method,which was obviously lower than control group (P<0.01).Compare with control group the expression of IL-2 and TNF-α in serum was increased in cordycepin in the middle,high dose group.The difference between two groups had statistical significance (P<0.05 or 0.01).ConclusionNorth Cordyceps could obviously inhibit the growth of tumor and enhance the immune functions in bearing mice.

Keywords:North Cordyceps;antitumor;immunological function;IL-2;TNF-α;mice

蟲草素(cordycepin)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的天然核苷類抗生素，也是自然界相對富集的天然抗癌抗生素，蟲草素即3-脫氮腺苷，為含氮配糖體的核酸衍生物，屬嘌呤類生物堿，有抗病毒，抗腫瘤作用，尤其對多種實體惡性腫瘤有很強的抑制作用[1]。北蟲草(蛹蟲草)與冬蟲夏草為蟲草屬的同屬異種真菌，兩者的化學成分、營養(yǎng)成分和藥用功能均非常相似，其主要藥用成分蟲草素等含量遠高于野生冬蟲夏草，而且比冬蟲夏草更易于人工栽培[2-3]。對北蟲草(蛹蟲草)化學成分的提取、分離、鑒定及藥理作用雖已有較多研究，但對于其化學成分北蟲草素與藥理活性關(guān)系還有待進一步深入研究[4-5]。原發(fā)性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，筆者以體外小鼠肝癌H22細胞和肝癌H22細胞荷瘤小鼠為實驗模型[6-7]，觀察從人工蛹蟲草中提取的北蟲草素對小鼠肝癌H22細胞生長的抑制作用以及對肝癌H22細胞荷瘤小鼠在體抑制瘤體作用，同時觀察其對瘤鼠血清中IL-2和TNF-α水平的影響。

1實驗材料

北蟲草素由南京中醫(yī)藥大學植物藥深加工中心應用人工蛹蟲草提取，人工蛹蟲草由南通市海安縣泓壽生物科技有限公司提供。小鼠肝癌H22細胞株,由南京中醫(yī)藥大學藥學院藥理實驗室惠贈。BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司，雌雄各半。RPMIDMEM培養(yǎng)基：美國Gibco公司；小牛血清購自杭州四季青生物有限公司;胰蛋白酶閃晶生物有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)AMRESCO;環(huán)磷酰胺(CTX)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；IL-2和TNF-α ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2實驗方法

2.1北蟲草素體外對H22細胞生長的影響將處于對數(shù)生長期的H22細胞調(diào)整密度為1×105個/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，24 h后,分別加入不同質(zhì)量濃度的北蟲草素，使其終質(zhì)量濃度分別為5，10，20，40，80 mg/L，同時設對照組。每組設6個復孔，置37 ℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，于570 nm波長處測各孔的吸光度(A)值，計算細胞的抑制率[8]=[(1-A)(給藥孔)/A(對照孔)]×100%。

2.2小鼠移植性腫瘤模型的建立及給藥收集肝癌H22細胞株，低速離心(10 000 r/min，5 min)3次，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，臺盼藍檢測細胞的存活率。將細胞(存活率≥95%)懸液0.2 mL注射至BALB/c小鼠右腋皮下，全程嚴格無菌操作[9]。24 h后采用隨機數(shù)字表法分5組(n=8)，即荷瘤對照組，環(huán)磷酰胺對照組及北蟲草素15、30、60 mg/kg 3個劑量組。同時設1組為不接種瘤株的生理鹽水正常對照組，正常與荷瘤空白對照組給予腹腔注射同體積的生理鹽水，環(huán)磷酰胺對照組給予20 mg/kg，各組均以10 mL/kg的體積連續(xù)腹腔給藥14 d，第15天麻醉，眼眶取血分離血清備用，小鼠斷髓處死,剝離瘤體,稱重。

2.3檢測指標動物體重增長率(%)=(給藥組增重-對照組增重)/對照組增重×100%；抑瘤率(%)=(荷瘤對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/荷瘤對照組平均瘤重×100%)；血清IL-2和TNF-α檢測，各組小鼠取血1 mL，不加抗凝劑，置于一次性離心管內(nèi)，以3 000 r/min，5 min，取血清置于-20 ℃保存。采用ELISA法測定，操作步驟按照試劑盒說明進行。

3結(jié)果

3.1北蟲草素對H22細胞增殖抑制作用的影響見表1。

表1　北蟲草素對H 22細胞增殖作用的影響 ± s)

3.2北蟲草素對荷瘤小鼠體質(zhì)量增長率的影響給藥前后除環(huán)磷酰胺組荷瘤鼠的體質(zhì)量增加的幅度較對照組明顯小(P<0.001)，其他各組體質(zhì)量均正常增加,而北蟲草素高劑量組增重明顯高于對照組(P<0.05)。說明環(huán)磷酰胺能夠損傷、加重荷瘤鼠的惡病質(zhì)體質(zhì)，導致其體質(zhì)量增加出現(xiàn)異常，而北蟲草素高劑量改善荷瘤鼠的惡病質(zhì)體質(zhì),提高生存質(zhì)量。見表2。

3.3北蟲草素對抑瘤率的影響由表3結(jié)果表明蟲草素抑瘤效果未能達到臨床一線抗癌藥物環(huán)磷酰胺的效果；其抑制腫瘤生長的效果與其劑量成依賴性梯度關(guān)系。

表2　各劑量組對荷瘤小鼠動物體質(zhì)量增長率的影響 ± s)

注：與空白對照組比較，# P<0.05，### P<0.001

注：與空白對照組比較，##P<0.01，###P<0.001

3.4北蟲草素各劑量組對H22荷瘤鼠血清IL-2和TNF-α水平的影響由表4結(jié)果可見，與荷瘤對照組相比,各給藥組能顯著提高荷瘤小鼠血清IL-2水平。與荷瘤對照組相比，各北蟲草組均提高荷瘤小鼠血清TNF-α水平；與空白、正常對照組相比,環(huán)磷酰胺組小鼠血清TNF-α水平顯著降低(P<0.001,表中未標記出)。提示環(huán)磷酰胺可能存在損傷荷瘤小鼠免疫因子TNF-α，而北蟲草素可能對免疫指標的損傷存在保護、改善的作用,這種作用也存在劑量依賴的關(guān)系。

組 別n劑量/(mg/kg)IL-2/(pg/mL)TNF-α/(pg/mL)空白組 8-154.7±28.4##62.4±4.2## 對照組 7097.2±25.1 47.3±5.3 環(huán)磷酰胺組620110.4±19.5# 18.9±1.6###北蟲草素低715115.7±27.5# 50.4±3.8 北蟲草素中830128.5±30.5# 68.4±5.7# 北蟲草素高860145.7±32.1##73.5±4.3##

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

4討論

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.)Link]為子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌科、蟲草屬的模式種。經(jīng)成分測定分析及藥理實驗證明可作為冬蟲夏草的替代品之一。蛹蟲草中主要活性成分蟲草素是蟲草中特有的活性成分，具有明顯的鎮(zhèn)靜、抗疲勞、抗腫瘤、抑制癌細胞和促使雄性激素分泌等作用，可增強機體免疫功能。根據(jù)蛹蟲草化學成分及藥理作用研究進展[10-11]，從其中提取的北蟲草素作為一種用途廣泛的新藥來開發(fā)是必然的趨勢[12-13]。

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