■ 李路勝 徐志祥 馮定遠(yuǎn) 徐 梅 馬 巖 鄭 濤 吳廣兵 龔俊勇 左建軍

（1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城 252000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510642；3.深圳市綠微康生物工程有限公司，廣東深圳 518055）

脂肪是畜禽營養(yǎng)需要中的主要供能物質(zhì)，但家禽對脂肪的消化還受到多種因素的影響，包括家禽品種、脂肪酸類型、日糧營養(yǎng)水平、抗?fàn)I養(yǎng)因子、食糜黏度等。脂肪酶的活性也受到各種內(nèi)源因素的影響，包括膽鹽、pH值、糜蛋白酶等（張鎮(zhèn)福等，2001；Nahashon等，2005；李勇等，2010；劉梅，2011）。肉雞生長早期或應(yīng)激條件下內(nèi)源脂肪酶的不足導(dǎo)致脂肪消化受限，為添加外源脂肪酶提供了依據(jù)。葉慧等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，添加脂肪酶能夠促進黃羽肉公雞發(fā)育，顯著增加平均日采食量和平均日增重，降低后期和全期料重比（P＜0.05）。脂肪酶的應(yīng)用多是直接添加于畜禽飼料中，這必然面臨兩個問題：一是加工處理對脂肪酶活性的影響；二是局限于畜禽動物腸道環(huán)境的影響，脂肪酶不能最大化發(fā)揮酶解效應(yīng)。理論上，油脂在體外經(jīng)脂肪酶水解處理后可起到前消化作用，提高飼料中利用效率，進而提高飼料中油脂有效能值。趙海珍等（2005）通過脂肪酶體外處理豬油，改良制備出了功能性脂。

目前，脂肪體外酶解處理多應(yīng)用于工業(yè)和食品等領(lǐng)域，至今未見針對飼用脂肪酶解前處理技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用。所以，本研究預(yù)計通過篩選并建立飼用油脂體外脂肪酶水解工藝參數(shù)，結(jié)合動物代謝和飼養(yǎng)試驗系統(tǒng)評估體外油脂脂肪酶水解處理對油脂能量價值以及其應(yīng)用于動物飼養(yǎng)后對肉雞生長性能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗用脂肪酶及油脂

微生物脂肪酶由某酶制劑公司提供，來源于黑曲霉；酶活力測定值為1 599.84 U/g；豬油由廣州至潤油廠提供。

1.2 脂肪酶體外水解天然油脂工藝參數(shù)篩選及其水解效果的測定

1.2.1 豬油酶解反應(yīng)及其條件

在貝塞瓶中加入1 g油脂（精確至0.000 1 g）、不同pH值（6.0、7.0、8.0、9.0）的50 mmol/l的Tris-HCl溶液5 ml、不同體積（1、2、3、4 ml）的脂肪酶溶液，在30、35、40、45 ℃水浴振蕩（150 r/min）反應(yīng)90 min。其中，pH值為7.0、2 ml脂肪酶液（即32 U/ml）、40 ℃為基礎(chǔ)參考處理參數(shù)。在此基礎(chǔ)上，旋轉(zhuǎn)水浴鍋中以150 r/min處理 24 h。

1.2.2 脂肪酸萃取

在混合反應(yīng)液中加入5 ml石油醚，充分振蕩后靜置10 min，然后轉(zhuǎn)入50 ml離心管5 000 r/min離心10 min。

1.2.3 脂肪酸甲酯化

吸取離心上清有機液1 ml，加入5 ml 1%H2SO4-甲醇溶液，70℃水浴反應(yīng)60 min，為防止溶液蒸發(fā)，在瓶口設(shè)置簡短的回流管。

待溶液反應(yīng)結(jié)束，冷卻后加入2.5 ml異辛烷和0.5 ml內(nèi)標(biāo)溶液混勻，隨后加入7 ml飽和NaCl溶液振蕩3 min，5 000 r/min離心10 min后吸取上層液備用。

1.2.4 氣相色譜儀測定

按照國標(biāo)《GB/T17377—2008動植物油脂脂肪酸甲酯的氣相色譜分析》步驟操作。

色譜柱：Nukol毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；柱溫：程序升溫，初始溫度80℃保持5 min，以10℃/min速率升至170℃，保持10 min，再以10℃/min速率升至195℃，保持10 min；進樣口溫度：220℃；檢測器溫度：250℃；載氣為高純氮氣；柱前壓：100 kPa；燃燒氣氫氣70 kPa，助燃?xì)饪諝?0 kPa；分流進樣方式，分流比為1∶20；進樣量為1 μl。

組分峰面積由GCSolution軟件計算。

式中：ρ——樣品中脂肪酸含量（g）；

A1、A2——分別為樣品中脂肪酸組分與內(nèi)標(biāo)峰面積；

A'1、A'2——分別為混標(biāo)溶液中脂肪酸組分與內(nèi)標(biāo)峰面積；

ρ'——混標(biāo)溶液中各脂肪酸甲酯含量（g）；

n——濃縮倍數(shù)。

1.2.5 豬油酶解反應(yīng)的水解率的計算

式中：ρi——各種脂肪酸含量（g）；

w ——油脂含量（g）。

1.3 脂肪酶對體外水解油脂有效能值的影響

體外脂肪酶不同條件水解處理后豬油的代謝能值測定過程參照Sibbald TME法進行。

1.3.1 動物分組及試驗設(shè)計

選取體況相近體重在2.5 kg左右的成年公雞為試驗動物，40只，隨機分配到4個處理，分別為A、B、C、D組。A和B為試驗組，C組為絕食組，D組為對照組。A組飼喂使用在篩選出最佳體外脂肪酶水解條件下處理后豬油的飼糧，B組飼喂使用未經(jīng)過酶解處理豬油的飼糧，C組為絕食處理，D組飼喂基礎(chǔ)飼糧。

1.3.2 試驗飼糧

根據(jù)中國肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（2004）的營養(yǎng)需要，設(shè)計各原料配比，計算出各原料配方。根據(jù)配方用精度0.5 g的天平稱量各原料?；A(chǔ)飼糧具體配方見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧配方

待測飼糧在基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上，用13.44%的豬油替代基礎(chǔ)飼糧（即100 kg試驗飼糧中，基礎(chǔ)飼糧占86.56 kg、豬油占13.44 kg），豬油來源的ME占總待測飼糧ME的34.03%。

1.3.3 飼養(yǎng)管理及樣品采集

公雞適應(yīng)期為5 d，各組都飼喂基礎(chǔ)飼糧；預(yù)試期3 d，預(yù)試期后禁飼排空期36 h后，A、B組強飼60 g（精確至0.000 2 g）使用不同豬油的待測飼糧，C組絕食，D組強飼60 g（精確至0.000 2 g）基礎(chǔ)飼糧，排泄物收集期為36 h，同時采集試驗日糧樣品。樣品處理按常規(guī)代謝試驗規(guī)程操作。

1.3.4 試驗測定指標(biāo)及方法

試驗飼糧中水分含量的測定：根據(jù)GB/T 6435—2006規(guī)程測定。試驗飼糧和排泄物的能量測定：采用德國IKA全自動氧彈計測定。試驗飼糧和排泄物粗脂肪測定：采用粗脂肪提取儀測定。

飼糧的TME值可依據(jù)以下公式計算得出：

式中：GE——攝入飼料的總能（Gross Energy，MJ）；

FE——排泄物的糞能（Energy in Feces，MJ）；

GF——攝入飼料的質(zhì)量（kg）；

t——采食飼料雞（只）；

f——絕食雞（只）。

油脂的TME可依據(jù)以下公式計算得出：

TME油=（TME試驗飼糧-TME基礎(chǔ)飼糧×基礎(chǔ)飼糧比例）/待測油脂比例。

1.4 酶解豬油與脂肪酶對肉雞生長性能的影響

1.4.1 飼養(yǎng)試驗設(shè)計

選取700只42日齡黃羽肉雞，共分成4個處理組，其中每個處理設(shè)5個重復(fù)，每重復(fù)35只雞（公雞18只，母雞17只）。處理1為正對照組（飼喂基礎(chǔ)日糧）；處理2為負(fù)對照組（飼喂日糧能量在基礎(chǔ)日糧水平上降低0.5 MJ/kg）；處理3為脂肪酶體外水解處理豬油日糧組，即使用脂肪酶體外水解后豬油的低能日糧組；處理4為負(fù)對照組+35 000 U脂肪酶/kg豬油。豬油經(jīng)過融化后用20 kg玉米粉吸附混合均勻后加入全價日糧中。

1.4.2 日糧配方和營養(yǎng)水平

試驗日糧參照中國肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（2004）設(shè)計，日糧配方和營養(yǎng)水平見表2。

1.4.3 飼養(yǎng)管理

黃羽肉雞由廣東粵禽育種公司提供，試驗期為21 d，即42～63日齡。全期自由采食、飲水，采用24 h光照制，免疫及飼養(yǎng)管理均按照常規(guī)管理程序進行操作。

1.4.4 生長性能

于第63日齡時以重復(fù)為單位對全群試驗雞進行空腹稱重（空腹期8 h，斷料不斷水）并統(tǒng)計用料量。以重復(fù)為單位，計算各處理組平均日采食量、42～63日齡的平均日增重和料重比。

1.5 脂肪酶對肉雞屠宰性能的影響

參照全國家禽育種協(xié)會公布的《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計方法1984》進行屠宰測定。

于第63日齡時，每個重復(fù)隨機選取2只接近平均體重的健康受試雞，記錄其活體重、胴體重量、半凈膛重和全凈膛重，并分離單側(cè)腿肌、胸肌和腹脂，記錄重量。

屠宰率（%）=胴體重量/畜禽活重×100；

半凈膛率（%）=半凈膛重/宰前體重×100；

全凈膛率（%）=全凈膛重/宰前體重×100；

腿肌率（%）=兩側(cè)腿肌重/全凈膛重×100；

胸肌率（%）=兩側(cè)胸肌重/全凈膛重×100；

腹脂率（%）=腹脂重/（全凈膛重+腹脂重）×100。

表2 基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件進行初步分析后，使用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析并用鄧肯氏新復(fù)極差法進行多重比較（P＜0.05為差異顯著）。試驗結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±SE）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶體外水解豬油的適宜工藝參數(shù)及其水解效果（見表3）

由表3可知，在pH值為堿性條件下的油脂水解率較高，其中pH值為8.0時達到78.62%；反應(yīng)溫度為30～40℃范圍內(nèi)，脂肪酶水解豬油的效率均達到60%以上，其中40℃條件下可達到76.54%的水解率；隨著脂肪酶添加量的增加，豬油水解效率增加，其中添加量達到3 ml和4 ml（即48 U/g豬油和64 U/g豬油）時，水解率分別達到79.61%和81.43%。

表3 不同反應(yīng)條件下脂肪酶對豬油的水解率

以最大水解效率為脂肪酶體外水解豬油反應(yīng)條件篩選的依據(jù)，本試驗條件下適宜的工藝參數(shù)為：pH值8.0、反應(yīng)溫度40℃、脂肪酶添加量64 U/g豬油。

2.2 脂肪酶對體外水解油脂有效能值的影響

脂肪酶體外水解豬油對其代謝能值影響的結(jié)果見表4。由表4可知，豬油體外脂肪酶處理之后的TME獲得了顯著提高，提高了4.81%（P＜0.05）。

表4 脂肪酶前處理對豬油及其TME的影響

2.3 脂肪酶對肉雞生長性能的影響（見表5）

表5 脂肪酶對42～63 d黃羽肉雞生長性能的影響

由表5可知，降低肉雞日糧能量水平降低了其日增重（P＞0.05）和飼料報酬（P＜0.05）；使用脂肪酶體外水解油脂替代未經(jīng)過處理油脂后顯著提高了肉雞采食量和日增重，相對處理2組的提高幅度分別達到5.10%（P＜0.05）和10.11%（P＜0.05）的改善效果。直接添加脂肪酶對肉雞日采食量和日增重提高效果顯著（P＜0.05），但對料肉比影響不顯著（P＞0.05）；使用酶解處理油脂或直接添加脂肪酶均改善了采食低能量日糧肉雞生長性能，其生長性能可達到甚至數(shù)值上超過正常能量日糧組肉雞的生長性能。

2.4 脂肪酶對肉雞屠宰性能的影響（見表6）

表6 脂肪酶對63 d黃羽肉雞屠宰性能的影響（%）

由表6可知，脂肪酶前處理油脂使用或直接在日糧中添加脂肪酶對肉雞屠宰性能的影響均不顯著（P＞0.05），且降低能量組相對正常能量組的差異也不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 脂肪酶前處理油脂的方法及其效果

脂肪酶在動物日糧中添加效果受到很多因素的影響，包括飼料加工制粒對脂肪酶活力的影響、消化道內(nèi)環(huán)境對脂肪酶活力的影響等。所以，避開飼料加工以及消化道內(nèi)環(huán)境的條件限制，利用飼用酶制劑在體外對飼料原料進行前處理，提高飼料可利用營養(yǎng)價值的技術(shù)思路具有重要的科學(xué)和實踐意義。而且，體外條件下，可根據(jù)酶的適宜反應(yīng)條件的需要，靈活設(shè)置反應(yīng)環(huán)境，最大化發(fā)揮酶的作用效率。

酶制劑前處理油脂的研究和應(yīng)用主要在食品方面開展了大量工作。宋少芳等（2006）利用脂肪酶催化α-2單硬脂酸甘油酯水解反應(yīng)活性的研究時發(fā)現(xiàn)，凝膠組成為微乳液配比為m（正庚烷）∶m（緩沖液）∶m（AOT）=75∶9∶16，明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17%，R值為72；酶含量固定，底物濃度大于0.10 mol/l時，脂肪酶可發(fā)揮最大催化活性；而且，反應(yīng)時間超過15 h，水解反應(yīng)達到平衡。陳少欣等（1995）篩選出游離酶最佳催化條件為pH值9.6、33℃、底物濃度25%時，水解率可達85.7%，此時游離脂肪酶動力學(xué)參數(shù)Vm和Km值分別為5.56μmol/（ml·min）和6.2×10-2（V/V）。在充分平衡各方面條件要求下，選擇適宜的工藝條件，油脂的水解率可達到90%～98%（高昆玉等，1992）。本試驗中，采用單因素分別篩選適宜體外酶解反應(yīng)pH值、溫度和酶添加劑量獲得的適宜反應(yīng)參數(shù)分別為pH值8.0、溫度40℃、酶添加劑量為64 U/g豬油，在此條件下獲得的豬油水解率達到80%的水平，這低于食品方面的報道結(jié)果，可能的原因是單個適宜參數(shù)組合之后可能出現(xiàn)組合效應(yīng)下降的問題。

針對體外酶解反應(yīng)條件的篩選，常用的方法除了單因素分別篩選之外，常用的方法還有響應(yīng)面分析法（RSM）。RSM是一種有效的處理復(fù)雜數(shù)據(jù)的統(tǒng)計方法，它也是一種最優(yōu)化的方法，它將體系中的響應(yīng)作為一個或多個因素的函數(shù)，并能運用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來，以供我們憑借直覺的觀察來選擇試驗設(shè)計中的最優(yōu)化條件。響應(yīng)面分析法最主要的優(yōu)點在于能夠減少試驗次數(shù)并能得到足夠的統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)。目前，響應(yīng)面分析法廣泛應(yīng)用于各種水解反應(yīng)和生物柴油的體外酶解反應(yīng)參數(shù)篩選合成反應(yīng)，以及食品和飼料酶制劑產(chǎn)品和加工工藝的優(yōu)化（Wang等，2008；Rodrigues等，2011；雷建平，2012）。

3.2 脂肪酶對肉雞生長性能的影響

一般脂肪可提供相當(dāng)于碳水化合物2.25倍的能量。添加脂肪可以較小的配方空間來提供較高的能量濃度滿足部分家畜對高能量的需求，能夠提高其他營養(yǎng)成分濃度；同時油脂還具有熱增耗低、抗熱應(yīng)激的特點。除了提供能量、提供必需脂肪酸等直接營養(yǎng)作用之外，油脂還具有特有的其他作用：①間接營養(yǎng)作用：提高脂溶維生素、色素利用；②非營養(yǎng)作用：潤滑機械，減少粉塵?；谏鲜鰞?yōu)點，加上肉雞生長速度快，需要能量濃度高，油脂在肉雞日糧的使用已經(jīng)成為不可或缺的原料之一。但是，在添加油脂的同時也帶來了脂肪過度沉積導(dǎo)致脂肪浪費和肉品質(zhì)下降的問題（李娟娟等，2008）。脂肪的消化必須有脂肪酶的催化，而且現(xiàn)代肉雞養(yǎng)殖的高強度、多應(yīng)激問題導(dǎo)致肉雞難于滿足高油脂日糧的脂肪消化和利用需要。如顏士祿等（2009）研究表明，不管是AA肉雞還是北京油雞都在生長早期和應(yīng)激條件下普遍存在內(nèi)源脂肪酶分泌不足的問題。所以，外源性脂肪酶添加非常必要性。

Tan等（2000）報道，在含高油玉米、全脂米糠、干苜蓿粉、餅粕等的飼糧中添加脂肪酶，可提高豬、禽表觀消化能5%～11%，提高日增重4%～10%，提高飼料轉(zhuǎn)化率2%～7%。葉慧等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加脂肪酶35 000 U/kg豬油能夠促進黃羽肉公雞發(fā)育，顯著增加平均日采食量和平均日增重，降低后期和全期料重比（P＜0.05），且降低后期黃羽肉公雞血清中總膽固醇和高、低密度脂蛋白的含量（P＜0.05）、提高高密度脂蛋白和低密度脂蛋白比值，不同程度地影響了黃羽肉公雞胸肌干物質(zhì)中蛋白質(zhì)和脂肪的含量；結(jié)果提示，添加脂肪酶能夠改善黃羽肉雞生長性能和脂質(zhì)代謝，并且影響胸肌營養(yǎng)成分的沉積。本試驗條件下，不管是使用酶解處理油脂或直接添加脂肪酶均改善了采食低能量日糧肉雞生長性能，其生長性能可達到甚至數(shù)值上超過正常能量日糧組肉雞的生長性能。外源性脂肪酶可提高飼料中的脂肪消化率，特別是可顯著提高米糠中的脂肪消化率，因而可提高米糠的表觀代謝能值和飼料轉(zhuǎn)化率（Pluske等，1997）。本研究在體外通過脂肪酶處理豬油發(fā)現(xiàn)，其肉雞TME值提高了4.81%（P＜0.05）

脂肪酶提高動物生長性能的可能作用機制主要體現(xiàn)在以下幾個方面：①彌補內(nèi)源脂肪酶不足，促進脂肪消化吸收（Pratuangde等，2000）；②調(diào)節(jié)CCK分泌，影響胰腺消化酶分泌和采食（Tanaka等，2008）；③與油脂協(xié)同作用，抑制腸道內(nèi)有害病菌繁殖（Dierick等，2004）；④改變脂肪水解產(chǎn)物，影響體內(nèi)脂質(zhì)代謝（Iqbal等，2009）。

4 結(jié)論

①本試驗條件下，脂肪酶體外水解豬油較適宜的pH值和溫度、酶添加劑量參數(shù)值分別為8.0、40℃、64 U/g豬油；在此條件下酶解處理后豬油代謝能值提高了4.81%。

②降低肉雞日糧能量水平導(dǎo)致其日增重和飼料報酬降低，使用酶解處理油脂或直接添加脂肪酶均改善了采食低能量日糧肉雞生長性能，其生長性能可達到甚至數(shù)值上超過采食正常能量日糧肉雞的生長性能。

③使用酶解處理油脂或直接添加脂肪酶對肉雞屠宰性能均沒有顯著影響。