■李艷嬌 白曉凱 張 敏 金英海 陳石婷 國傳福

（1.延邊大學(xué)，吉林延邊 133000；2.琿春市龍裕農(nóng)業(yè)發(fā)展集團有限公司，吉林琿春 133300）

硒是人、動物以及植物體必不可少的微量元素之一，它對維持機體正常新陳代謝以及多種疾病的發(fā)生均相關(guān)，同時，硒是谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心元素，具有抗氧化、延緩衰老，保護、修復(fù)細胞的作用，而且硒對增強肌體的免疫能力、抗病能力等方面均有顯著的影響。目前，對于補硒的方法大多數(shù)均是以無機硒（如亞硒酸鈉）化合物的狀態(tài)進行的，由于無機硒化合物具有毒性高、吸收率低的弊端，所以如何將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，使微量元素的利用率提高、毒性降低也越來越受到國內(nèi)外有關(guān)學(xué)者的關(guān)注。

目前對于將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒的方法有生物轉(zhuǎn)化與氨基酸結(jié)合、植物自然轉(zhuǎn)化法、微生物轉(zhuǎn)化法（如酵母菌硒）等。自20世紀70年代以來，國內(nèi)外利用酵母菌將無機的微量元素轉(zhuǎn)化為有機的微量元素已有較多研究，對于利用乳酸菌為載體富集微量元素的文獻報道尚少。乳酸菌作為一種有益菌，不僅對食品的獨特風(fēng)味方面有作用，而且對醫(yī)療保健作用方面也有明顯的效果，它可靠的安全性也已被消費者所認可，富硒乳酸菌作為有機硒的一個新來源，其潛在的發(fā)展前景非常廣闊。

隨著乳酸菌富硒技術(shù)的逐漸成熟，越來越多的學(xué)者開始尋找生產(chǎn)有機硒的其它方法。我國作為農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)產(chǎn)品資源非常豐富，但對于農(nóng)副產(chǎn)品的利用，提高其附加價值方面還比較薄弱。本試驗以乳酸菌發(fā)酵有機米糠富硒，將乳酸菌的某些功能特性與有機米糠中的營養(yǎng)相結(jié)合，同時將無機硒以微生物發(fā)酵的方法轉(zhuǎn)化為有機硒，開發(fā)新型飼料添加劑，以實現(xiàn)農(nóng)副產(chǎn)品作為新型資源的突破，也將為農(nóng)副產(chǎn)品在未來的發(fā)展中提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

由新鮮腌制的辣白菜中提取，所用辣白菜在延邊大學(xué)超市購買。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉粉10 g、酵母浸出粉5 g、磷酸氫二鉀（K2HPO4）2 g、檸檬酸三銨2 g、乙酸鈉2 g、葡萄糖20 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、吐溫801 ml、蒸餾水1 000 ml，pH值6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

MRS瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉粉10 g、酵母浸出粉5 g、磷酸氫二鉀（K2HPO4）2 g、檸檬酸三銨2 g、乙酸鈉2 g、葡萄糖20 g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、吐溫80 1 ml、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 ml，pH值6.2～6.4，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：有機米糠、營養(yǎng)液（MRS液體培養(yǎng)基）。

1.1.3 試劑

亞硒酸鈉（AR）、濃硝酸、高氯酸、濃硫酸、過氧化氫、甲苯；0.9%NaCl、40%氫氧化鈉溶液、5%氫氧化鈉溶液、2 mol/l甲酸溶液、0.5%3,3-二氨基聯(lián)苯胺溶液、5%乙二胺四乙酸二鈉溶液。

1.1.4 儀器

高壓滅菌鍋（HVA-85，日本Hirayama）、超凈工作臺（SW-CJ-1FD）、恒溫培養(yǎng)箱（MJ-150-Ⅰ，昆山 一恒儀器）、電熱鼓風(fēng)干燥箱、冰凍離心機（SIEVA-2，德國HERMLE）、紫外可見分光光度計（UV759，上海佑科）、電子分析天平（MD100-2）。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離、純化

將泡菜汁用滅菌后的0.9%NaCl分別稀釋至10-1～10-6，然后分別進行平板涂布培養(yǎng)48 h，之后挑選具有乳酸菌菌落特征的單一菌落，采用劃線分離純化，純化若干次后，獲得單一菌種。如此純化若干次后，選取典型的菌落進行活化并擴繁培養(yǎng)。

1.2.2 菌種的活化

挑取純化幾次后的單一菌落，將其接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，之后將活化的菌種進行擴繁培養(yǎng)并測定吸光度，直至OD600nm為0.6，即得到種子液。

1.2.3 乳酸菌生長曲線的測定

將活化好的乳酸菌進行液體培養(yǎng)后，測定生長曲線，以確定亞硒酸鈉最適的添加時間。種子液以1%的接種量接入到MRS液體培養(yǎng)基中，裝液量為50 ml/150 ml，37℃靜止培養(yǎng)，采用比濁法，每個4 h測定乳酸菌液的OD600nm值，繪制生長曲線（見圖1）。

圖1 乳酸菌生長曲線

1.2.4 富集培養(yǎng)

根據(jù)需要將亞硒酸鈉配好滅菌備用。在超凈工作臺中將亞硒酸鈉溶液按不同量加入到滅菌好的MRS液體培養(yǎng)基中，混勻，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)一定時間。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)

將有機米糠進行分裝、滅菌備用。在超凈工作臺中將培養(yǎng)好的富硒乳酸菌液加到分裝好的有機米糠中，攪拌均勻，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6 培養(yǎng)物的洗滌及分離

培養(yǎng)物→離心（25℃、4 000 r/min）20 min，傾去上清液→加入300 ml雙蒸水，攪拌均勻→離心（4 000 r/min）20 min，傾去上清液。如此反復(fù)幾次，將細胞表面的無機硒洗去。最后以4 000 r/min離心20 min獲得最終培養(yǎng)物。

1.2.7 測定方法

準確稱取0.1 g試樣，并加少量水潤濕樣品，然后加入消化液（雙氧水∶高氯酸∶硫酸=3∶3∶1），搖勻，置電爐上消化至終點（若消化不完全可稍冷后補加雙氧水繼續(xù)加熱消化至完全，此過程在通風(fēng)櫥內(nèi)完成）。冷卻至室溫后，繼續(xù)加5%EDTA-2Na溶液2 m1，搖勻，用40%氫氧化鈉于冷水浴中調(diào)pH值至中性，然后定容至100 m1，同法做空白溶液。

1.3 發(fā)酵條件的篩選

1.3.1 有機米糠添加量的篩選

將米糠添加量（22～46 g）以外的其它培養(yǎng)條件按培養(yǎng)基裝液量為60 ml，接種量3%，種齡16 h，培養(yǎng)溫度33℃對發(fā)酵培養(yǎng)基進行靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)36 h后，分別測定每個培養(yǎng)基的生物量，根據(jù)生物量來選擇合適的米糠添加量。

1.3.2 培養(yǎng)基裝液量的篩選

在已篩選好的有機米糠添加量的基礎(chǔ)上，接種量、種齡條件不變，將種子液接種于不同裝液量的發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度為33℃的條件下培養(yǎng)36 h，測定發(fā)酵培養(yǎng)中乳酸菌的生物量。

1.3.3 接種量的篩選

在發(fā)酵培養(yǎng)中分別接入不同接種量的種子液，在溫度為33℃的條件下培養(yǎng)36 h，測定乳酸菌生物量，選擇最適的接種量。

1.3.4 種齡的篩選

在上述條件基礎(chǔ)上，根據(jù)不同種齡的種子液對米糠的發(fā)酵情況，確定乳酸菌最佳的的菌種種齡。

1.3.5 培養(yǎng)時間的篩選

綜合篩選出的最佳發(fā)酵條件，將發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵時間設(shè)為24～60 h的梯度，在33℃條件下培養(yǎng)，確定最佳的培養(yǎng)時間。

1.3.6 培養(yǎng)溫度的篩選

將培養(yǎng)基在28、31、34、37、40 ℃條件下培養(yǎng)，根據(jù)乳酸菌的生物量確定最佳的培養(yǎng)溫度。

1.3.7 Na2SeO3添加量的篩選

我們已經(jīng)根據(jù)米糠的發(fā)酵程度和乳酸菌的生物量確定了發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵的最佳條件。結(jié)合最佳的發(fā)酵條件，在培養(yǎng)基中添加不同量的亞硒酸鈉，最后由生物量及有機硒生產(chǎn)水平來選擇合適的亞硒酸鈉添加量。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機米糠添加量對富硒乳酸菌生物量的影響

圖2 有機米糠添加量對富硒乳酸菌生物量的影響

由圖2可知，乳酸菌生物量隨著有機米糠添加量的增加而增加，當米糠加量為34 g時，生物量最高；米糠加量大于34 g時，隨著添加量的增加，培養(yǎng)基中更多的培養(yǎng)液被米糠利用，不能為乳酸菌的生長提供充足的營養(yǎng)，造成了乳酸菌生物量呈現(xiàn)下降的趨勢。因此在培養(yǎng)基中適宜的有機米糠添加量應(yīng)為34 g。

2.2 培養(yǎng)基裝液量對富硒乳酸菌生物量的影響

圖3 培養(yǎng)基裝液量對富硒乳酸菌生物量的影響

從圖3可以看出，裝液量對乳酸菌生物量的影響較顯著，隨著裝液量的增加生物量為先上升后下降的生長趨勢；培養(yǎng)基中營養(yǎng)液的裝液量為55 ml時，生物量最高；由于乳酸菌為厭氧菌，培養(yǎng)液的裝液量超過55 ml時，將會抑制乳酸菌的生長，因而導(dǎo)致生物量逐漸下降。

2.3 接種量對富硒乳酸菌生物量的影響

圖4 接種量對富硒乳酸菌生物量的影響

由圖4可以看出，接種量的大小對乳酸菌生物量的多少有直接的影響。隨著接種量的增加生物量逐漸增加，當接種量較大時（接種量大于9%），會造成乳酸菌生長過快，培養(yǎng)基中營養(yǎng)供應(yīng)不足，使得乳酸菌不能夠充分的生長；接種量過小時（接種量小于9%），乳酸菌生長代謝的較慢，進而影響發(fā)酵的時間。

2.4 種齡對富硒乳酸菌生物量的影響

圖5所示，在0～16 h時，乳酸菌生物量與種齡呈正相關(guān)；當種齡為16～20 h時，乳酸菌的生長情況呈直線下降趨勢，生物量也迅速減少；在8～16 h時，乳酸菌生長最好，生物量最高。種齡少于8 h時，種子仍處于調(diào)整適應(yīng)的階段；種齡大于16 h時，開始老化衰退。

2.5 培養(yǎng)時間對富硒乳酸菌生物量的影響

圖6所示，乳酸菌生物量隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，且生長速度較快。當培養(yǎng)到48 h時，生物量最理想，為10.601 g/l；培養(yǎng)48 h后，生物量開始出現(xiàn)下降的趨勢，所以，培養(yǎng)時間應(yīng)為48 h較合適。

圖5 種齡對富硒乳酸菌生物量的影響

圖6 培養(yǎng)時間對富硒乳酸菌生物量的影響

2.6 培養(yǎng)溫度對富硒乳酸菌生物量的影響

圖7 培養(yǎng)溫度對富硒乳酸菌生物量的影響

由圖7可以看出，隨著溫度的不斷升高乳酸菌生長的較為旺盛，生物量也隨之增加，當溫度達到37℃時，生物量最高；溫度大于37℃時，過高的溫度對乳酸菌的生長有抑制作用，生物量開始呈現(xiàn)下降趨勢。

2.7 Na2SeO3添加量對富硒乳酸菌生物量及有機硒生產(chǎn)水平的影響

從圖8可以看出，亞硒酸鈉的添加量對乳酸菌生物量和富硒效果均有影響。隨著培養(yǎng)基中硒濃度的增加，生物量出現(xiàn)逐漸下降的趨勢，相反的是富硒量呈現(xiàn)上升的趨勢。因為亞硒酸鈉具有一定的毒性，對乳酸菌的生長有抑制作用。

圖8 Na2SeO3添加量對富硒乳酸菌生物量及有機硒生產(chǎn)水平的影響

有機硒生產(chǎn)水平（mg/l）=富硒乳酸菌有機硒含量（mg/g）×發(fā)酵米糠乳酸菌生物量（g/l）

2.8 發(fā)酵米糠營養(yǎng)成分分析

表1 普通有機米糠與乳酸菌發(fā)酵有機米糠營養(yǎng)成分分析(%)

由表1可以看出，乳酸菌發(fā)酵的有機米糠營養(yǎng)成分與未發(fā)酵的普通米糠沒有顯著性差異。蛋白質(zhì)和鈣的含量略有提高，但差異不顯著；其它營養(yǎng)成分均有不同程度的降低，差異不顯著(P＞0.05)。

3 結(jié)論

綜上所述，本試驗通過一系列的篩選條件，最終確定了乳酸菌發(fā)酵有機米糠富硒的最優(yōu)條件：有機米糠添加量34 g、培養(yǎng)基裝液量55 ml、接種量9%、種齡8～16 h、發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度37℃、亞硒酸鈉添加量100 mg/l，而且，在此條件下發(fā)酵有機米糠，乳酸菌的生物量可達9.94 g/l，有機硒的生產(chǎn)水平為7.46 mg/l。

（參考文獻12篇，刊略，需者可函索）