■張璐璐 衛(wèi)旭彪 斯大勇 鄭召君 馬 廣 張日俊

（中國農(nóng)業(yè)大學飼料生物技術(shù)實驗室動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193）

我國是世界上生產(chǎn)和消費玉米、大豆的大國，2013年中國玉米產(chǎn)量達到21 500萬噸以上，大豆消費量約為7 118萬噸。玉米纖維和豆渣是玉米和大豆在加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物。玉米纖維和豆渣由于理化性質(zhì)的特殊性，因而它們作為動物飼料有很多的限制。近年來，國內(nèi)外對玉米纖維和豆渣如何高質(zhì)化利用進行了大量研究，常用的方法主要有物理法、化學法、物理化學法和生物法。但是，現(xiàn)在產(chǎn)業(yè)中處理玉米纖維和豆渣采用的強烈溶劑法處理，幾乎會導致玉米纖維中100%水溶性纖維、50%～60%半纖維素和10%～30%纖維素溶解，從而造成營養(yǎng)物質(zhì)的極大損失[1]。同樣，采用物理方法對糧食加工副產(chǎn)物處理也造成營養(yǎng)物質(zhì)的極大損失。每年我國面對龐大的糧食加工副產(chǎn)物的現(xiàn)實，采用微生物處理是最好的選擇。芽孢桿菌在食品和工業(yè)領域已經(jīng)安全運用多年，其對營養(yǎng)要求不高，具有較強的產(chǎn)酶能力，易于分離、培養(yǎng)，抗逆性強。動物飼料中運用產(chǎn)酶的菌株較多的是芽孢桿菌。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些產(chǎn)纖維素酶能力較強的芽孢桿菌。梁艷玲(2014)[2]從生境中篩選出一株地類芽孢桿菌ME27-1，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 h后，其CMC酶酶活為0.17 U/ml。陳珊等(2014)[3]從長白山森林土壤中篩到一株地衣芽孢桿菌，在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后，其CMC酶酶活為1.82 U/ml。Abdullah等（2014）[4]利用物理和化學誘變得到一株CMC酶最大酶活為1 250 U/ml的芽孢桿菌N3。Gaur等（2015）[5]從土壤中分離到一株纖維素酶最大酶活為4 105 U/ml的芽孢桿菌RG-07。本試驗根據(jù)芽孢桿菌能產(chǎn)芽孢、抗逆性強和產(chǎn)酶量大的特性，從土壤、牛瘤胃液、馬糞便、牛糞便和實驗室保藏菌種等生境中篩選出一株高產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌，并進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤、腐木、腐葉、牛瘤胃液、馬糞便、雞盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物、青貯飼料、牛糞便、納豆和實驗室保藏菌種由中國農(nóng)業(yè)大學飼料生物技術(shù)試驗室提供。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑配制

NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基(葡萄糖6 g、酵母膏10 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、KH2PO41 g，蒸餾水500 ml,18%的 Na2CO3500 ml，pH值6.8)、纖維素酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉20 g、玉米纖維20 g、干豆渣30 g、牛肉膏3 g、蛋白胨2 g、NaCl 5 g、MgSO40.5 g、Na2HPO41 g、KH2PO41 g，蒸餾水1 000 ml，pH值6.8，0.5%的CMC-Na)、剛果紅CNC-Na平板、淀粉平板、酪蛋白平板、CMC-Na培養(yǎng)基、pH值4.8乙酸緩沖液、DNS試劑、10 mg/ml的木糖標準貯備液、10 mg/ml的葡萄糖標準貯備液。

1.3 產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的分離篩選

1.3.1 芽孢桿菌富集

取2 g或2 ml新鮮樣品，加入盛有18 ml無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩2～3 min混勻，靜置2 h，吸取5 ml上清液，加入無菌試管中，然后80℃水浴20 min。按10%接種量將水浴后菌液接種到NB培養(yǎng)基中，180 r/min、37℃搖床富集24 h。

1.3.2 芽孢桿菌分離

對富集后的培養(yǎng)液進行梯度稀釋，選取10-4、10-5、10-6梯度在NA培養(yǎng)基上涂布，每個稀釋度3個平行，37℃培養(yǎng)24 h得到單菌落，根據(jù)菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢，挑取單菌落進行NA斜面保存。

1.3.3 產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌初篩

采用平板劃線法，從斜面上挑選菌株在剛果紅CNC-Na平板上劃線，37℃培養(yǎng)48 h，觀察是否出現(xiàn)透明圈。挑選生長快、透明圈大的單菌落接種到NB培養(yǎng)基中，180 r/min、37℃搖床培養(yǎng)24 h后制成發(fā)酵種子液。用滅菌牙簽蘸取少量菌液點種于CNC-Na平板上，37℃培養(yǎng)2～4 d，采用0.2%的剛果紅染色30 min，用蒸餾水和1 mol/l NaCl依次洗去染液。測量透明圈和菌落直徑并計算其比值，挑選比值較大的菌落進行復篩。

1.3.4 產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的復篩

將篩到的產(chǎn)纖維素酶能力強的菌株在種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，以4%的接種量接種到裝有100 ml纖維素酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，180 r/min、37℃搖床培養(yǎng)48 h后，在5 000 r/min的離心機上離心10 min，收集上清液即為待測粗酶液。測定所篩菌株的CMC酶酶活，篩選出產(chǎn)纖維素酶能力強的菌株。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態(tài)學鑒定

觀察目標菌株在NA平板上形成的菌落形態(tài)，革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察菌體和芽孢形態(tài)。

1.4.2 分子生物學鑒定

用細菌基因組提取試劑盒提取總DNA，利用設計引物P1和P2對gyrA基因片段進PCR擴增。正向引物 P1：5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′，反向 引 物 P2：5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′。對所提芽孢桿菌DNA進行PCR擴增。采用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測DNA提取情況。將擴增后的基因送測序公司測序，并對所測的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對以確定菌種。

1.5 產(chǎn)纖維素酶酶活測定

將篩到的菌群在種子培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，以4%的接種量接種到裝有100 ml纖維素酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中，180 r/min、37 ℃搖床培養(yǎng)48 h后，在5 000 r/min的離心機上離心10 min，收集上清液即為待測粗酶液。測定所篩菌株的纖維素內(nèi)切葡聚糖酶酶活、外切葡聚糖酶和木聚糖酶酶活。

1.6 產(chǎn)淀粉酶及蛋白酶能力測定

用滅菌的牙簽蘸取少量的菌液分別點種于淀粉平板和酪蛋白平板上，37℃培養(yǎng)48 h，直接觀察酪蛋白平板的菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，在淀粉平板表面滴加碘液觀察是否出現(xiàn)水解圈。

1.7 模擬胃液試驗

取1 mol/l的鹽酸加水稀釋至pH值為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5，每個pH值樣品分別取30 ml至100 ml三角瓶中121℃滅菌20 min，冷卻至室溫，用濾菌器向每個三角瓶中加入0.5 g胃蛋白酶，搖勻后待用，將培養(yǎng) 12 h后的菌液3 ml加入各三角瓶中，分別測定解淀粉芽孢桿菌B13在0、1、2、3、4 h的OD600nm，并計算相對含量。

1.8 模擬腸液試驗

將A液（A胰腺液：稱取 1.1 g碳酸氫鈉，0.85 g氯化鈉加入100 ml蒸餾水中，用氫氧化鈉調(diào)pH值至6.8，121℃滅菌20 min，冷卻后，無菌操作下加入1.5 g胰蛋白酶混合備用）和B液（B膽液：稱取1.2 g牛磺酸膽鹽加入至100 ml蒸餾水中，121℃滅菌20 min。冷卻備用）以2∶1體積混合即可得到人工腸液，每個三角瓶取100 ml人工腸液，放置待用。將培養(yǎng)12 h后的菌液3 ml加入各三角瓶中，分別測定解淀粉芽孢桿菌B13在0、1、2、3、4 h的OD600nm，并計算相對含量。

1.9 抑菌能力測定

圖1 在纖維素平板上的水解圈

將金黃色葡萄球菌接種于BPY液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h，稀釋活菌數(shù)為106CFU/ml，取100 μl涂布于BPY平板。將待測解淀粉芽孢桿菌B13培養(yǎng)24 h后12 000 r/min離心10 min，取200 μl上清液加入牛津杯中，37℃培養(yǎng)12 h，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌篩選

剛果紅染色是最簡單且被廣泛用于產(chǎn)纖維素酶菌株篩選。本試驗從25個樣品中分離到28株能夠產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌（見圖1）。對篩到的28株菌進行CMC-Na平板篩選，并測量計算菌落直徑、透明圈直徑、透明圈直徑與菌落直徑的比值(見表1)。選取透明圈直徑與菌落直徑比值較大或水解圈較大的菌株進行纖維素內(nèi)切葡聚糖酶活力測定(見表2)。由表2可知，菌株B13內(nèi)切葡聚糖酶酶活最高為7.31 U/ml，選定此菌株為目標菌株。

表1 產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的初篩

表2 產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的復篩(U/ml)

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定

芽孢桿菌在NA平板上呈乳白色、圓形、褶皺、邊緣整齊的菌落(見圖2)。鏡檢菌株為革蘭氏陽性菌，菌體為桿狀，兩端鈍圓，單個或成對排列，芽孢端生。

圖2 芽孢桿菌B13菌落形態(tài)（左）及革蘭氏染色（右）

2.2.2 分子生物學鑒定

16S rDNA/RNA基因序列雖然被廣泛應用于細菌的鑒定和細菌的系統(tǒng)進化關(guān)系構(gòu)建，但是其不能用于序列相似度很高的枯草桿菌群的類群間分類[6-7]。gyrA是一段高度保守的基因片段，利用gyrA基因能夠有效地區(qū)分枯草芽孢桿菌組中的近緣種[8]。本試驗采用gyrA序列對所篩到的目標菌株B13的基因序列進行分析，在GenBank中對其擴增產(chǎn)物的序列進行比對發(fā)現(xiàn)，所篩的B13菌株序列片段與GenBank中解淀粉芽孢桿菌的序列片段相似性達99%，從而鑒定其為解淀粉芽孢桿菌。

2.3 產(chǎn)纖維素酶酶活測定

解淀粉芽孢桿菌B13經(jīng)液態(tài)發(fā)酵后，其纖維素內(nèi)切葡聚糖酶酶活為7.31 U/ml的菌株B13作為目標菌株，并測定其纖維素外切葡聚糖酶酶活為5.26 U/ml，木聚糖酶酶活為32.46 U/ml。

圖3 解淀粉芽孢桿菌B13在淀粉平板上的水解圈(左)及在酪蛋白平板上的水解圈（右）

2.4 產(chǎn)淀粉酶及蛋白酶檢測

把芽孢桿菌接種到淀粉平板和酪蛋白平板，發(fā)現(xiàn)所篩目標菌株能夠產(chǎn)淀粉酶(見圖3左)和蛋白酶(見圖3右)。

2.5 模擬胃液試驗

動物胃中較低的pH值能夠殺死大部分微生物[9]，然而芽孢桿菌作為益生菌能夠產(chǎn)生芽孢，有一定的抗逆性。本試驗測定了篩選到的解淀粉芽孢桿菌B13在不同pH值模擬胃液下，作用不同時間，解淀粉芽孢桿菌B13的相對存活率，結(jié)果見表3。由表3可知，該芽孢桿菌對模擬胃液有一定的耐受性；當pH值≥2.0時，處理1 h該芽孢桿菌不但不致死，而且還能生長，但處理時間超過1 h后該芽孢桿菌的相對存活率逐漸下降；pH值1.5對該菌影響較大，在此pH值下處理4 h其相對存活率為65.4%。

表3 解淀粉芽孢桿菌B13耐模擬胃液試驗結(jié)果(%)

2.6 模擬腸液試驗

動物腸道中存在大量的微生物，也是益生菌發(fā)揮作用的主要場所[10]。小腸偏堿性有利于芽孢桿菌的生長，然而，小腸中存在大量的酶及膽鹽，不利于芽孢桿菌的生長[11-12]。本試驗測定了解篩選到的解淀粉芽孢桿菌B13在模擬腸液中作用不同時間芽孢桿菌B13的相對存活率，結(jié)果見圖4。由圖4可知，該芽孢桿菌對模擬腸液的耐受性較弱，該菌的相對存活率隨著時間逐漸降低；模擬腸液處理2 h，該株芽孢桿菌相對存活率為56.6%，處理1 h，該株芽孢桿菌相對存活率為84.8%。

圖4 解淀粉芽孢桿菌B13模擬腸液試驗結(jié)果

2.7 抑菌能力試驗

取芽孢桿菌培養(yǎng)物的上清液，進行牛津杯37℃培養(yǎng)12 h后，發(fā)現(xiàn)未出現(xiàn)透明圈（見圖5），即該芽孢桿菌未能產(chǎn)生抗金黃色葡萄球菌的物質(zhì)。

圖5 解淀粉芽孢桿菌B13抑菌試驗

3 結(jié)論

通過初篩和復篩，本試驗從生境中分離到一株產(chǎn)纖維素酶能力強的芽孢桿菌B13，對B13菌株進行形態(tài)學和分子生物學鑒定后，確定為解淀粉芽孢桿菌。其中纖維素內(nèi)切葡聚糖酶酶活為7.31 U/ml，纖維素外切葡聚糖酶酶活為5.26 U/ml，木聚糖酶酶活為32.46 U/ml。此菌株能夠產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶，并且對模擬胃液有很高的耐受性，對模擬腸液有一定的耐受性。在模擬胃液試驗中，在對該菌影響最大pH值1.5條件下，處理4 h其相對存活率為65.4%；該菌在模擬腸液中，處理1 h，該株芽孢桿菌相對活菌數(shù)是84.8%，處理2 h，該株芽孢桿菌相對活菌數(shù)為56.6%。該菌對金黃色葡萄球菌沒有抑制作用。