■ 袁香麗 宋 凱 王 玲 張春曉 李曉麗

(1.集美大學農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建廈門361021；2.集美大學廈門市飼料檢測與安全評價重點實驗室，福建廈門361021)

殼寡糖(Oligochitosan，COS)是指2～10個氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的低聚糖，也是自然界中大量存在的唯一的堿性氨基寡糖[1]，研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖具有調節(jié)免疫力、抗氧化、抑制腫瘤生長及抗炎反應、增強骨強度、抗菌、抗瘧疾等作用[2-6]。研究認為，殼寡糖分子中的游離氨基帶正電荷，可以與微生物表面的脂多糖和蛋白等陰離子物質發(fā)生靜電相互作用，從而改變微生物細胞膜的通透性，阻止外界營養(yǎng)物質的進入和細胞內成分的釋放，最終導致微生物死亡[7-8]。殼寡糖具有廣譜抑菌活性，可以抑制多種植物病原菌、食品微生物以及人體和其它動物病原菌的生長。

副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）和溶藻弧菌（V.alginolyticus）是對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中兩種重要的致病弧菌，發(fā)病率高，危害大。研究報道，溶藻弧菌會引起對蝦黑鰓病和褐斑病，副溶血弧菌則引起對蝦紅腿病等[9]。對于弧菌病的防治，以往一直采用抗生素和消毒劑等化學藥物治療，然而使用化學藥物會引起藥物殘留和抗藥性的問題，不僅造成環(huán)境污染，而且給食品安全帶來危害。殼寡糖作為一種新型的綠色飼料添加劑，其資源豐富，且無毒、無副作用，并且可以抑制有害菌，應用前景廣闊，而有關殼寡糖對副溶血弧菌和溶藻弧菌抑制作用的研究尚不深入。

本試驗選用副溶血弧菌和溶藻弧菌做為研究對象，采用平板計數(shù)法確定殼寡糖的作用濃度，研究殼寡糖對蝦養(yǎng)殖中常見弧菌的抑制效果，旨在為殼寡糖在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌

副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）和溶藻弧菌（V.alginolyticus），由集美大學水產(chǎn)學院病理實驗室從感染這兩種弧菌的凡納濱對蝦體內分離得到。

1.2 主要試劑

殼寡糖（所用殼寡糖分子量≤2 000 Da，脫乙酰度≥90%，聚合度2～8，來源于螃蟹殼，中泰和（北京）科技發(fā)展有限公司）、牛肉膏（上海源聚生物科技有限公司）、胰蛋白胨（北京陸橋技術有限公司）、瓊脂粉（上海捷瑞生物工程有限公司）、酵母提取物（英國OXOID）、氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）等。

1.3 殼寡糖溶液的配制

配制好的殼寡糖溶液，滅菌后備用。不同添加水平殼寡糖溶液的配制見表1。

表1 殼寡糖溶液的配制

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種活化

菌種活化所用的培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基，配好的培養(yǎng)基置于100 ml的錐形瓶中經(jīng)121℃滅菌20 min后從滅菌鍋里取出，放置在無菌操作臺里，通風冷卻至室溫，接種副溶血弧菌和溶藻弧菌后于37℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，進行第一次活化；第二次活化時將配好的LB液體培養(yǎng)基置于250 ml的錐形瓶進行活化，方法同第一次。菌體第二次活化完成后以10倍梯度稀釋涂布法進行菌落計數(shù)。

1.4.2 殼寡糖對副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）的抑制試驗

取菌液用生理鹽水進行梯度稀釋，副溶血弧菌稀釋至10-6，溶藻弧菌稀釋至10-5。試驗時吸取1 ml的菌懸液與1 ml殼寡糖溶液置于5 ml離心管中混勻，放置培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，分別在0、2、4、6 h進行平板涂布，24 h后進行菌落計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤（Mean±S.E.）”表示，采用SPSS 17.0分析軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），若存在顯著的差異，則采用Duncan's法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 殼寡糖對副溶血弧菌的抑制作用（見表2）

由表2可知，不同濃度殼寡糖組隨著濃度升高，副溶血弧菌活菌數(shù)均有所減少，且隨著殼寡糖濃度的升高及作用時間的延長其對副溶血弧菌的抑制作用增強。殼寡糖濃度為0%時，作用時間0 h除外，在任何時間點的活菌落數(shù)均顯著高于其他添加殼寡糖水平組（P＜0.05），作用時間0 h，殼寡糖濃度為0.03%時，活菌落數(shù)顯著高于0.12%殼寡糖組（P＜0.05），與其他組差異不顯著（P＞0.05）；0.09%、0.12%的殼寡糖溶液作用時間在2、4、6 h時各組活菌數(shù)量顯著低于其他組（P＜0.05），作用時間為6 h時，殼寡糖溶液濃度為0.09%和0.12%試驗組的活菌落數(shù)均低于其他各組。

表2 不同濃度的殼寡糖對副溶血弧菌數(shù)量的影響

2.2 殼寡糖對溶藻弧菌的抑制作用（見表3）

由表3可知，殼寡糖溶液對溶藻弧菌作用0 h時，0%、0.03%、0.06%組之間溶藻弧菌活菌數(shù)無顯著差異（P＞0.05），但與0.09%和0.12%組相比，活菌數(shù)量顯著高于這兩組（P＜0.05）；當殼寡糖溶液對溶藻弧菌作用時間分別為2 h和4 h時，0%和0.03%組之間溶藻弧菌活菌數(shù)無顯著差異（P＞0.05），而0.09%和0.12%組溶藻弧菌活菌數(shù)顯著低于其他組（P＜0.05）；當作用時間為6 h時，各組間均呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），且0.12%組殼寡糖組活菌數(shù)量最少。

表3 不同濃度的殼寡糖對溶藻弧菌數(shù)量的影響

3 討論

本研究結果顯示，隨著時間的延長及殼寡糖濃度的增加，副溶血弧菌和溶藻弧菌活菌數(shù)量減少，意味著殼寡糖對兩種弧菌具有一定的抑制作用。Liu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對大腸桿菌的抑制效果與作用時間具有顯著相關性，添加殼聚糖2 h后大腸桿菌數(shù)量顯著下降。王壽權等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度殼寡糖其抑菌時間也會延長。閆海俠等[12]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)殼寡糖處理后大腸桿菌活菌數(shù)量在0～4 h內明顯減少。本研究結果表明，時間顯著影響殼寡糖對兩種弧菌抑制效果，隨著作用時間的延長高濃度殼寡糖呈現(xiàn)出更好的抑菌效果。

有研究報道，殼寡糖的抑菌活性與其濃度密切相關。劉碧源等[13]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖和殼寡糖均具有明顯的抑菌作用，并且其抑菌活性隨著濃度的升高而增強。王壽權等[11]自制殼寡糖的抑菌試驗表明，自制殼寡糖具有較強的抑菌活性，而且隨著濃度升高，抑菌活性不斷增強。謝勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度殼聚糖對幽門螺桿菌抑菌作用隨著殼聚糖濃度的增加而增強，但當濃度大于4%時,其抑菌作用不再增強。有研究發(fā)現(xiàn)，100～1 000 μg/ml殼聚糖能夠抑制R.solani和S.rolfsii孢子產(chǎn)生、萌發(fā)以及菌絲生長，且抑制作用具有濃度依賴性[15]。Li等[16]發(fā)現(xiàn)，濃度為2 000 μg/ml殼聚糖能夠顯著抑制細菌的生長，500 μg/ml殼聚糖乙酸鹽溶液反而能促進細菌的生長，故而認為低濃度殼聚糖可被微生物分解利用，并促進其生長。因此，目前研究者普遍認為殼聚糖的抑菌性能是隨著濃度的增大而增強的[10，17-18]。本試驗中所使用殼寡糖的分子量≤2 000 Da，脫乙酰度≥90%，聚合度為2～8，結果顯示，隨著殼寡糖濃度的增加，其具有較好的抑菌活性，這與上述研究結果類似。

Pyo等[19]研究表明，雜殼聚糖及其寡糖對副溶血弧菌的抗菌效果與它們的分子量、脫乙酰度及所使用的菌株有關。Shin等[20]研究中處理非編織布料所用的殼寡糖分子量為1 814 Da，脫乙酰度為84%，當濃度為0.01%時對普通變形桿菌的抑菌率就達到90%，而對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌需0.05%，對肺炎克雷伯桿菌和銅綠假單胞菌即使?jié)舛冗_到1.0%，抑菌率也只有30%。本試驗結果表明，殼寡糖對副溶血弧菌和溶藻弧菌的抑制作用皆隨其濃度增加和作用時間延長而顯著增強，但當殼寡糖水平和作用時間不同時對兩種菌的抑制效果存在差異，說明本試驗條件下殼寡糖材料對副溶血弧菌和溶藻弧菌都有較好的抑制作用，且對不同病原菌的抑菌活性也存在一定差異。

4 結論

本試驗中所用殼寡糖（分子量≤2 000 Da，脫乙酰度≥90%，聚合度為2～8）在體外對凡納濱對蝦致病菌——副溶血弧菌和溶藻弧菌皆有抑制作用，并且抑菌效果與殼寡糖濃度以及作用時間顯著相關，建議應進一步研究殼寡糖在對蝦養(yǎng)殖中的應用。