多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選補(bǔ)正續(xù)骨顆粒最佳提取工藝

田原，樊暉，關(guān)雪峰*， 張錫瑋，孫科峰

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110032)

摘要：目的優(yōu)選補(bǔ)正續(xù)骨顆粒的提取工藝。方法采用L9(34)正交試驗(yàn)法，以出膏率為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳水提取工藝，以川續(xù)斷皂苷Ⅵ與柚皮苷總含量及出膏率綜合評分為評價指標(biāo)，優(yōu)選最佳乙醇提取工藝。結(jié)果最佳水提取工藝為加6倍量水，提取2次，每次提取1 h。最佳乙醇提取工藝為加6倍量60%乙醇，提取3次，每次2 h。結(jié)論優(yōu)選的提工藝穩(wěn)定可行，適用于補(bǔ)正續(xù)骨顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)正續(xù)骨顆粒；川續(xù)斷皂苷Ⅵ；柚皮苷；正交試驗(yàn)

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2015.06.014

中圖分類號：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：2095-6258(2015)06-1134-03

基金項(xiàng)目：遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2013226012)；遼寧中醫(yī)藥大學(xué)“杏林學(xué)者青藍(lán)工程”。

作者簡介：田原( 1969-) ，女，副主任藥師，主要從事中藥質(zhì)量分析與新藥開發(fā)。

收稿日期:(2015-02-13)

*通信作者：關(guān)雪峰, 電話-(024)31961111，電子信箱-lnzygxf@163.com

Optimization of extraction technology for Buzheng Xugu granules by multi-index comprehensive evaluation method

TIAN Yuan，F(xiàn)AN Hui，GUAN Xuefeng*，ZHANG Xiwei, SUN Kefeng

(Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China)

Abstract：ObjectiveTo optimize extraction technology of Buzheng Xugu granules. MethodsOrthogonal experimental design was adopted, dry extract rate as evaluation index, to optimize water extraction technology, contents of asperosaponin；naringin and dry extract as evaluation index，to optimize ethanol extraction technology. ResultsOptimal water extraction technology was extracted 2 times with 6 times the amount of water for 1 h per time; optimal ethanol extraction technology was extracted 3 times with 6 times the amount of 60% ethanol for 2 h per time. ConclusionThis optimized extraction technology was stable, feasible, suitable for Buzheng Xugu Granules production.

Keywords：Buzheng Xugu granules; asperosaponin; naringin; orthogonal experimental design

補(bǔ)正續(xù)骨丸為遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由制何首烏、菟絲子、鹿茸、續(xù)斷、合歡花、骨碎補(bǔ)等8味藥組成，具有壯腰補(bǔ)腎、強(qiáng)壯筋骨等功效，主要用于治療慢性挫傷，腰肌勞損等療效顯著。本課題擬將補(bǔ)正續(xù)骨丸開發(fā)成更加便于攜帶和服用的補(bǔ)正續(xù)骨顆粒。根據(jù)方中藥味所含有效成分的理化性質(zhì)，方中枸杞子采用水煎煮法進(jìn)行提??；鹿茸采用粉碎后原粉加入的方法，制何首烏等其他藥味采用乙醇提取的方法，本文采用L9(34)正交試驗(yàn)法，以出膏率及有效成分含量相結(jié)合為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳水提取工藝和醇提取工藝。

1材料

1100型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)，AE-240型電子分析天平(梅特勒-托利多公司)，HN101-3A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(南通滬南科學(xué)儀器有限公司)。鹿茸等藥材購自河北安國市神禾中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定，均符合2010年版《中國藥典》相關(guān)項(xiàng)下要求；川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號20130126，純度HPLC≥98%)，柚皮苷(中國藥品生物制品檢定所，批號110722-200309)，乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2．1枸杞子水提取工藝考察[1]2．1．1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以出膏率為考察指標(biāo)，考察加水量，煎煮時間，煎煮次數(shù)對提取結(jié)果的影響，采用四因素三水平L9(34) 正交試驗(yàn)法優(yōu)選最佳水提取工藝，因素與水平見表1。

表1　水提取正交試驗(yàn)因素水平表

2．1．2干膏率的測定稱取枸杞子藥材共9分，每分40 g，分別按各因素水平煎煮，濾過，合并提取液，濃縮，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥至恒重，精密稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏率。

2．1．3試驗(yàn)結(jié)果正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，表3。

表2　正交設(shè)計(jì)表及試驗(yàn)結(jié)果

表3　方差分析表

由表2、表3結(jié)果可知，各因素均不是顯著性因素，由直觀分析，C因素即提取次數(shù)對結(jié)果影響最大，提取1次與提取2次差別較大，但提取2次與提取3次差別很小，而A、B因素各水平差別均較小，因此，結(jié)合大生產(chǎn)實(shí)際，為節(jié)約成本，以A1B1C2作為最佳提取工藝，即加水6倍量，提取2次，每次提取1 h。

2．1．4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)取藥材40 g，共3分，按以上工藝操作，測定出膏率。結(jié)果平均出膏率分別為26．29%，RSD 1．8%。表明水提取工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

2．2制何首烏等醇提取工藝考察[2-3]

2．2．1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以川續(xù)斷皂苷Ⅵ 、柚皮苷[4]總含量及干膏率綜合評分作為考察指標(biāo)，乙醇濃度，加醇量，提取次數(shù)，提取時間為影響因素，采用四因素三水平L9(34) 正交試驗(yàn)法，優(yōu)選最佳提取工藝。因素水平表見表4。

表4　乙醇提取正交試驗(yàn)因素水平表

2．2．2川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量測定

2．2．2．1色譜條件采用Agilent TC-C18色譜柱(4．6 mm×250 mm，5 μm)，乙腈-水(31∶69)為流動相；檢測波長為212 nm；流速1．0 mL/min，柱溫25 ℃。

2．2．2．2對照品溶液制備取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含有對照品0．5 mg的溶液。

2．2．2．3供試品溶液制備取研細(xì)干膏0．5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，超聲30 min,濾過,取濾液備用。

2．2．2．4測定法分別精密吸取對照品與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，計(jì)算含量。

2．2．2．5方法學(xué)考察經(jīng)線性范圍考察，川續(xù)斷皂苷Ⅵ進(jìn)樣量在2．078～12．468 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系，回歸方程Y=156．99X-12．09(r=0．999 9)；精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD 0．9%，表明儀器精密度良好；8 h穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果RSD 0．8%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性較好；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果RSD 1．1%，表明本方法重復(fù)性較好；平均加樣回收率97．82%，RSD 2．8%。

2．2．3柚皮苷含量測定

2．2．3．1色譜條件采用Agilent TC-C18色譜柱(4．6 mm×250 mm，5 μm)，甲醇-水(38∶62)為流動相；檢測波長為283 nm；流速1．0 mL/min，柱溫25 ℃。

2．2．3．2對照品溶液制備取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含有對照品0．05 mg的溶液。

2．2．3．3供試品溶液制備取研細(xì)干膏1．0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，超聲30 min，濾過，取濾液備用。

2．2．3．4測定法分別精密吸取對照品與供試品溶液各20 μL,注入高效液相色譜儀，測定，計(jì)算含量。

2．2．3．5方法學(xué)考察柚皮苷進(jìn)樣量在0．27～1．62 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系，線性回歸方程Y=2 325X+60．1(r=0．999 7)；精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD 1．2%，表明精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果RSD 1．0%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定；重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果RSD 2．1%，表明本方法重復(fù)性較好；平均加樣回收率98．01%，RSD 2．3%。

2．2．4試驗(yàn)結(jié)果按處方比例取藥材，每分136 g，共9分，按照因素水平表和L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。將每分提取液濃縮，70 ℃減壓干燥，得干膏。以川續(xù)斷皂苷Ⅵ及柚皮苷總含量及干膏率作為考察指標(biāo)，進(jìn)行綜合評價(含量和干膏率的權(quán)重系數(shù)分別為0．7、0．3)優(yōu)選最佳提取工藝。綜合評分方差分析結(jié)果見表5。

注: #P<0．05

由表5中結(jié)果可知，A、D因素為顯著性因素，各因素主次為D>A>C>B，由直觀分析可知，最佳工藝為A2B1C2D3，即加6倍量60%乙醇，提取3次，每次2 h。

2．2．5驗(yàn)證試驗(yàn)按處方比例稱取處方量藥材，共3分，按最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果川續(xù)斷皂苷Ⅵ及柚皮苷的平均提取量分別為17．66、3．01 mg/g，RSD分別為2．1%、2．8%，平均干膏率27．64%，RSD為1．7%，表明該提取工藝穩(wěn)定可行。

3結(jié)論

川續(xù)斷皂苷Ⅵ為方中續(xù)斷指標(biāo)性成分，柚皮苷為骨碎補(bǔ)指標(biāo)性成分，二者與補(bǔ)正續(xù)骨顆粒功能主治密切相關(guān)，因此采用二者總含量為考察指標(biāo)。曾嘗試采用HPLC同時測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ[5-10]和柚皮苷[11-15]，結(jié)果分離度不好，陰性液有干擾，故分別測定。

參考文獻(xiàn)：

[1]孫琦,書洋,孟令軍,等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選參杞補(bǔ)氣顆粒中枸杞子、香菇及刺五加提取工藝[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,30(6):1006-1008.

[2]高軍,劉富春.正交試驗(yàn)優(yōu)選積實(shí)中柚皮苷的提取工藝[J]. 中國藥房,2014,25(35):3291-3293.

[3]谷丹丹,鄧洪,覃瑤,等. 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化川續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取工藝[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2013,24(7):1587-1588.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典: 1部[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社,2010:239,309.

[5]樊媛潔,翟永松,王滿元.不同炮制方法對續(xù)斷飲片中川續(xù)斷皂苷Ⅵ,Ⅹ含量的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(17):22-24.

[6]章彩霞,金靈華.續(xù)斷壯骨膠囊中總皂苷和川續(xù)斷皂苷VI 含量測定[J].中國執(zhí)業(yè)藥師,2014,11(2/3):8-11.

[7]吳春園,王俊,高錦飚.高效液相色譜法測定仙靈骨葆膠囊中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量[J]. 中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2014,8(17):238-239.

[8]單秀明,王瑾,吳愛英. HPLC法測定跌打片中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量[J]. 中國藥師,2013,16(3):388-390.

[9]彭鍵. 高效液相色譜法測定跌打丸中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量[J]. 中南藥學(xué),2012,10(1):25-28.

[10]陳華,陳妙芬,葉柳賢.HPLC法測定骨松寶膠囊中續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2013,19(3):87-88.

[11]聞輝,李曉春,王沛等.HPLC法測定腰腿痛寧中柚皮苷的含量[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(1):36-37.

[12]全維明,李博.高效液相色譜法測定骨質(zhì)增生散中柚皮苷的含量[J].時珍國醫(yī)國藥,2013,24(8):1892-1893.

[13]范興,楊成梓,曾偉生,等.HPLC 法測定燙骨碎補(bǔ)中柚皮苷的含量[J].海峽藥學(xué),2013,25(11):74-76.

[14]劉巖.HPLC 法測定參蘇片中柚皮苷的含量[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,30(3):417-418.

[15]司徒偉良,陳琳,李海斌,等.RP-HPLC法測定橘紅化痰丸中柚皮苷的含量[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2015,31(1):43-45.