張志剛+楊自文+王開(kāi)梅+張遵霞

摘要：以番茄早疫病菌（Alternaria solani）作為產(chǎn)孢病原菌的代表，進(jìn)行了孢子濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其敏感性影響的篩選試驗(yàn);以小麥穎枯病菌（Septoria nodorum Berk）作為不產(chǎn)孢病原菌的代表，進(jìn)行了菌絲碎片計(jì)數(shù)，同時(shí)比較了接菌濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其敏感性影響的篩選試驗(yàn);用兩個(gè)殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了篩選穩(wěn)定性比較試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)576個(gè)微生物源提取物進(jìn)行了篩選試驗(yàn)。結(jié)果表明，殺菌劑篩選必須控制接菌濃度和培養(yǎng)時(shí)間，從而保持適當(dāng)?shù)幕钚悦舾卸?，才能得到穩(wěn)定的篩選結(jié)果。適當(dāng)降低接菌濃度和縮短培養(yǎng)時(shí)間可以提高活性樣品的敏感度，有效的減少低活性樣品的漏篩。

關(guān)鍵詞：番茄早疫病菌（Alternaria solani）;小麥穎枯病菌（Septoria nodorum Berk）;先導(dǎo)化合物;殺菌活性;微生物源提取物

中圖分類(lèi)號(hào)：S482.4 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）23-5896-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.024

Studies on Screening of Lead Compounds of Fungicide from Microorganism

ZHANG Zhi-gang，YANG Zi-wen，WANG Kai-mei，ZHANG Zun-xia

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center/The Branch Center of Biopesiticide， Hubei Agricultural Scientific and

Technological Innovation Center）

Abstract：One was Alternaria solani， which could produce a large number of spores in PDA medium. The other one was Septoria nodorum Berk， which couldn't produce spores in PDA medium. The sensitivity of screening results had been studied with different concentration of spores and infection time of A. solani. Homogenized the mycelia of S. nodorum Berk， and counted the number of mycelia fragments after filtration with Nylon net， and the sensitivity of screening had been studied with different concentration of mycelia fragments and infection time too. The two pathogenic fungus had been tested for their responses to 2 commercial fungicide standards， and had screened with 576 microbial extracts. The results showed that the stable screening results based on the appropriate sensitivity. The sensitivity affected by the appropriate inoculation concentration and incubation time of infection. Reduce the inoculation concentration and incubation time could improve sensitivity of screening， also could ensure that low active compounds would not be missed.

Key words：Alternaria solani;Septoria nodorum Berk;lead compound; fungicidal activity;microbial extract

為了提高篩選效率，殺菌劑先導(dǎo)化合物篩選不僅要有多個(gè)具有代表性的靶標(biāo)，同時(shí)還要有高度敏感性，這與常規(guī)殺菌活性測(cè)定有很大差別。由于先導(dǎo)化合物在原材料中含量低、活性低，其對(duì)常規(guī)殺菌劑靶標(biāo)無(wú)明顯活性甚至不顯示活性，因此先導(dǎo)化合物的篩選必須盡可能提高篩選靶標(biāo)的敏感度，以增大具有潛在農(nóng)藥活性的先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)機(jī)率。半固體法因其便于使用微孔板進(jìn)行高通量篩選，常作為先導(dǎo)化合物篩選的首選方法。部分農(nóng)業(yè)病原真菌在培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢或產(chǎn)孢量少，因而只能用菌絲進(jìn)行篩選，而菌絲的接種量難以定量，往往導(dǎo)致篩選結(jié)果不穩(wěn)定。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，活性樣品被加速消耗，同時(shí)真菌量還在加速增長(zhǎng)。針對(duì)以上種種影響殺菌劑篩選穩(wěn)定性的因素，本試驗(yàn)以番茄早疫病菌和小麥穎枯病菌為模式靶標(biāo)，從接菌濃度、培養(yǎng)時(shí)間兩方面對(duì)其敏感度的影響因素進(jìn)行了篩選研究。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試菌種 ?番茄早疫病菌（Alternaria solani）和小麥穎枯病菌（Septoria nodorum Berk）由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心養(yǎng)蟲(chóng)室提供，試驗(yàn)用病原真菌菌種保存溫度為-70 ℃，經(jīng)過(guò)活化后，再擴(kuò)大培養(yǎng)。放線(xiàn)菌和真菌發(fā)酵提取物由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心先導(dǎo)化合物研究室提供。endprint

1.1.2 ?儀器與試劑 ?儀器、設(shè)備主要有臺(tái)式高速攪拌機(jī)（0-7 000 轉(zhuǎn)/min）、血球計(jì)數(shù)板、光學(xué)顯微鏡、高壓滅菌鍋、超聲波振蕩器、電子移液器（MCE8k）、96孔組織培養(yǎng)板（深孔、淺孔）、人工氣候箱（光、溫可調(diào)）、無(wú)菌操作臺(tái)。試劑主要有乙醇、吐溫-80、PDA、PDB培養(yǎng)基，均為市售穩(wěn)定生化試劑;殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)樣品有95%嘧菌酯（SIGMA-ALDRICH，C22H17N305）、98%咪鮮胺（SIGMA-ALDRICH，C15H16C13N302）;瓊脂粉（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，型號(hào)DH010-4）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?供試病原真菌培養(yǎng)物準(zhǔn)備 ?番茄早疫孢子懸浮液制備：取擴(kuò)大培養(yǎng)3周后的純培養(yǎng)物（直徑9 cm培養(yǎng)皿），在培養(yǎng)皿中加入10 mL無(wú)菌水，用刮鏟輕刮培養(yǎng)物表面，洗下孢子，制成孢子懸浮液。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)。其中混有部分菌絲，用滅菌的醫(yī)用紗布將菌絲過(guò)濾掉。小麥穎枯病菌菌絲懸浮液制備：將擴(kuò)大培養(yǎng)3周后的純培養(yǎng)物（300 mL三角瓶，加入100 mL PDB培養(yǎng)），加入到高速攪拌機(jī)中，以5 000 r/min的速度攪拌2 min，經(jīng)尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾液即為菌絲懸浮液。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行碎菌絲計(jì)數(shù)。

1.2.2 ?番茄早疫病菌孢子接種濃度選擇試驗(yàn)[1] ?以標(biāo)準(zhǔn)PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入0.7%瓊脂配制成感染培養(yǎng)基。根據(jù)1.2.1中番茄早疫病菌孢子懸浮液中的孢子濃度，用感染培養(yǎng)基（接種溫度55 ℃左右）進(jìn)行稀釋。孢子濃度分別稀釋為10 000、5 000、2 500、1 250、625、312、156、78個(gè)/mL。接種后的培養(yǎng)基分裝到96孔組織培養(yǎng)板（淺孔）中培養(yǎng)，每孔接入0.1 mL，溫度20 ℃，相對(duì)濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強(qiáng)度3 000 lx。每個(gè)濃度使用8個(gè)復(fù)孔。從第二天開(kāi)始持續(xù)觀(guān)察真菌生長(zhǎng)情況。

1.2.3 ?小麥穎枯病菌碎菌絲接種濃度選擇試驗(yàn)[2] ?以標(biāo)準(zhǔn)PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入0.7%瓊脂配制成感染培養(yǎng)基。根據(jù)1.2.1中小麥穎枯病菌菌絲懸浮液濃度，用感染培養(yǎng)基（接種溫度55 ℃左右）進(jìn)行稀釋。碎菌絲濃度分別稀釋為100 000、50 000、25 000、12 500、6 250、3 120、1 560、780個(gè)/mL。接種后的培養(yǎng)基分裝到96孔組織培養(yǎng)板（淺孔）中培養(yǎng)，每孔接入0.1 mL。培養(yǎng)條件為溫度20 ℃，相對(duì)濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強(qiáng)度3 000 lx。每個(gè)濃度使用8個(gè)復(fù)孔。從第二天開(kāi)始持續(xù)觀(guān)察真菌生長(zhǎng)情況。

1.2.4 ?番茄早疫病菌對(duì)殺菌劑的敏感性試驗(yàn)[3]

1）殺菌活性評(píng)價(jià)指標(biāo)。根據(jù)殺菌活性反應(yīng)的不同，使用分級(jí)指標(biāo)數(shù)（0、3、5、7、9）標(biāo)記殺菌活性[4]。

2）把兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品配制成母液，濃度為0.2 mg/mL，以含0.05% TW-80的無(wú)菌水稀釋成12個(gè)不同的濃度梯度。組織培養(yǎng)板中感染培養(yǎng)基加入量為0.09 mL/孔，樣品稀釋液加入量為0.01 mL/孔。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)。重復(fù)試驗(yàn)3次。培養(yǎng)條件為：溫度20 ℃，相對(duì)濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強(qiáng)度3 000 lx。從第二天開(kāi)始檢查并記錄結(jié)果，計(jì)算LC50的平均值。

1.2.5 ?番茄早疫病菌和小麥穎枯病菌的不同接菌濃度對(duì)微生物源提取物的敏感性試驗(yàn)[5] ?隨機(jī)選擇6批微生物提取物，每批提取物96個(gè)樣品，共576個(gè)提取物。把提取物配制成母液，濃度為4 mg/mL。以含0.05%TW-80的無(wú)菌水稀釋到0.8 mg/mL。組織培養(yǎng)板中感染培養(yǎng)基加入量為0.09 mL/孔，提取物樣品稀釋液加入量為0.01 mL/孔。提取物終濃度為0.08 mg/mL。每個(gè)樣品用一個(gè)濃度，設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)條件為：溫度20 ℃，相對(duì)濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強(qiáng)度3 000 lx。從第二天開(kāi)始檢查并記錄活性率。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?番茄早疫病菌孢子接種濃度的選擇結(jié)果

每個(gè)濃度使用8個(gè)復(fù)孔，觀(guān)察各孔中菌絲生長(zhǎng)情況，累計(jì)菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)基的孔數(shù)。第五天后菌絲過(guò)度生長(zhǎng)，開(kāi)始向周?chē)讛U(kuò)散生長(zhǎng)，此時(shí)停止繼續(xù)觀(guān)察。為了便于比較活性情況，理想的孢子接種量應(yīng)該是在菌絲過(guò)度生長(zhǎng)前，陰性對(duì)照組的菌絲剛剛長(zhǎng)滿(mǎn)或者接近長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)。結(jié)果（表1）顯示，孢子接種量為625 和1 250 個(gè)/mL時(shí)，接近理想接種量。綜合菌絲過(guò)度生長(zhǎng)的時(shí)限，把感染培養(yǎng)時(shí)間定為4 d，孢子接種量定為1 000 個(gè)/mL。

2.2 ?小麥穎枯病菌碎菌絲接種濃度的選擇結(jié)果

每個(gè)濃度使用8個(gè)復(fù)孔，觀(guān)察各孔中菌絲生長(zhǎng)情況，累計(jì)菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)基的孔數(shù)。第七天后組織培養(yǎng)板周邊孔內(nèi)培養(yǎng)基開(kāi)始失水干裂，所以停止繼續(xù)觀(guān)察。為了便于比較活性情況，理想的接種量應(yīng)該是在菌絲過(guò)度生長(zhǎng)前，陰性對(duì)照組的菌絲剛剛長(zhǎng)滿(mǎn)或者接近長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)。結(jié)果（表2）顯示，碎菌絲接種量在25 000 個(gè)/mL和50 000 個(gè)/mL時(shí)，接近理想接種量。綜合菌絲過(guò)度生長(zhǎng)的時(shí)限，我們把感染培養(yǎng)時(shí)間定為4 d，接種量定為30 000 個(gè)/mL。

2.3 ?番茄早疫病菌對(duì)殺菌劑敏感性的試驗(yàn)效果

根據(jù)2.1的試驗(yàn)結(jié)果，感染培養(yǎng)基中孢子最終濃度為1 000 個(gè)/mL。表3顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，嘧菌酯對(duì)番茄早疫病菌的LC50快速增大，說(shuō)明番茄早疫病菌敏感性逐步降低;而咪鮮胺對(duì)番茄早疫病菌的LC50緩慢增大，第五天的LC50僅是第二天的兩倍;并且番茄早疫對(duì)兩種殺菌劑在相同培養(yǎng)時(shí)間的敏感性差別較大。

2.4 ?番茄早疫病菌和小麥穎枯病菌的不同接菌量對(duì)微生物源提取物敏感性試驗(yàn)結(jié)果endprint

根據(jù)2.1和2.2的試驗(yàn)結(jié)果，感染培養(yǎng)基中番茄早疫病菌孢子的終濃度設(shè)為兩個(gè)，分別為10 000 個(gè)/mL和1 000 個(gè)/mL;小麥穎枯病菌菌絲碎片終濃度分別為100 000 個(gè)/mL和30 000個(gè)/mL。分別加入提取物樣品，培養(yǎng)4 h后，統(tǒng)計(jì)活性樣品檢出率。表4顯示，番茄早疫病菌接種孢子量從10 000個(gè)/mL降低到1 000 個(gè)/mL時(shí)，活性樣品檢出率提高到原來(lái)的2倍;小麥穎枯病菌接種碎菌絲量從100 000個(gè)/mL降低到30 000個(gè)/mL時(shí)，活性樣品檢出率提高到原來(lái)的3倍?？梢?jiàn)降低接菌量可以提高篩選的敏感度。

3 ?小結(jié)與討論

殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)番茄早疫病菌和小麥穎枯病菌的活性試驗(yàn)結(jié)果表明，不同病原真菌在篩選中的適宜接種量有較大差異，殺菌活性與供試真菌的接種量和培養(yǎng)時(shí)間均呈負(fù)相關(guān)。應(yīng)用微生物源提取物進(jìn)行的篩選試驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)論。由于農(nóng)業(yè)病原真菌種類(lèi)多，殺菌劑先導(dǎo)化合物篩選必須選擇多個(gè)模式病原菌進(jìn)行篩選，才能有效地利用樣品資源[6]。使用半固體培養(yǎng)基法作為初篩方法，可以提高篩選能量，但存在活性不穩(wěn)定的問(wèn)題，特別是在人工培養(yǎng)基中很難產(chǎn)生孢子的靶標(biāo)，其菌絲常常相互交織在一起，無(wú)法定量接種。通過(guò)切斷菌絲，并過(guò)濾，可以獲得長(zhǎng)度相近的菌絲段，進(jìn)而實(shí)行菌絲定量接種。在菌絲計(jì)數(shù)前，培養(yǎng)物在高速轉(zhuǎn)動(dòng)的刀片作用下，升溫比較快。同時(shí)由于菌絲被切斷時(shí)引起的損傷，會(huì)使部分碎菌絲失去活力，因此必須控制單次攪拌時(shí)間，防止培養(yǎng)物在短時(shí)間內(nèi)升溫過(guò)快。由于病原菌對(duì)樣品的敏感特異性、接種量、培養(yǎng)時(shí)間引起篩選活性樣品檢出率不同，在實(shí)際應(yīng)用中，有必要針對(duì)每一個(gè)病原真菌，使用適合的接菌量和培養(yǎng)時(shí)間?？紤]到活性檢出率過(guò)高會(huì)增加后續(xù)色譜分析和組分殺菌活性定量分析的工作量，在實(shí)際篩選中，把多個(gè)靶標(biāo)的活性樣品檢出率總比例控制在15%以下比較合適。

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