朱小茜　齊婷婷

摘 要：為降低高山杜鵑組織培養(yǎng)中外植體的褐化程度，實驗對高山杜鵑組織培養(yǎng)中不同的外植體（頂芽、葉片、帶腋芽的莖段）、不同的基本培養(yǎng)基和不同的抗褐化劑等進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，高山杜鵑不同的外植體褐化率不同，其中帶腋芽的莖段的褐化率最低；活性炭對外植體褐變起到了很好的抑制作用，其中以添加1.0g/L的活性炭時外植體褐化率最低。

關(guān)鍵詞：高山杜鵑；組織培養(yǎng)；褐化；抗褐化劑

中圖分類號 S685 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）24-46-03

Abstract：To overcome the explants browning in tissue culture process of Rhododendron lapponicum，the different explants，different antioxidants and different basic mediums were tested in this study.The results indicated that the browning rate of different explant was different.Stem section with axillary buds had the lowest browning rate. Explants browning could be effectively prevented in the medium contained 1.0g/L activated carbon.

Key words：Rhododendron lapponicum；Tissue culture；Browning；Antioxidant

高山杜鵑（Rhododendron lapponicum）又名紅山茶，是杜鵑花科高山常綠灌木或小喬木植物，多生長在海拔較高的山地陰坡上，花朵有白色、粉色、紅色等多種顏色，色澤鮮艷，呈球形開放，作為禮品花和新興的年宵花卉，深受人們的喜愛[1]。但是高山杜鵑含有黃酮類化合物、多酚類物質(zhì)，在組織培養(yǎng)時其外植體容易產(chǎn)生褐化現(xiàn)象，使其生長、分化受到抑制，甚至死亡[2]。為此，本實驗對高山杜鵑組織培養(yǎng)過程中褐化現(xiàn)象的控制進(jìn)行了研究，以期為高山杜鵑組織培養(yǎng)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試外植體材料采自安徽省霍山，取生長旺盛的高山杜鵑新生葉片、頂芽和帶腋芽的幼嫩莖段，用水沖洗掉表面灰塵。在超凈工作臺上用濃度為1‰的升汞消毒8min，無菌水漂洗4次。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 不同外植體的褐化現(xiàn)象 外植體分別取新生葉片、頂芽、新梢上帶腋芽的莖段，切取為大小適中的小塊接種在1/4MS+TDZ0.2mg/L+IAA0.4mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，pH為5.5。葉片切成邊長為1～1.5cm的正方形，帶腋芽的莖段取大約1cm長。每種外植體接種20瓶，每瓶接入1個外植體，3次重復(fù)。

1.2.2 不同的基本培養(yǎng)基對高山杜鵑褐變的影響 切取長約1cm的帶腋芽的幼嫩莖段分別接種于以下4種基本培養(yǎng)基中：Read、MS、1/2MS、1/4MS，每一培養(yǎng)基中都添加TDZ0.2mg/L+IAA0.4mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH為5.5。每種培養(yǎng)基20瓶，每瓶接入1個帶腋芽的莖段，3次重復(fù)。

1.2.3 抗褐化劑對高山杜鵑褐變的抑制 在1/4MS+TDZ0.2mg/L+IAA0.4mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L培養(yǎng)基中分別添加不同的的抗褐化劑：活性炭（O.5，1，1.5g/L）、聚乙烯吡咯烷酮PVP（0.4，0.8，1.2g/L），pH為5.5。每種培養(yǎng)基20瓶，每瓶接入1個帶腋芽的莖段，3次重復(fù)。

1.2.4 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度：22～24℃；光照時間：11h/d；光照強(qiáng)度：2 500lx。

1.3 統(tǒng)計分析 每隔4d觀察并記錄外植體的褐化及生長情況，36d后對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。相關(guān)計算公式如下：

褐化率（%）=（褐變的外植體總數(shù)/接種的外植體總數(shù)）×100；

增殖系數(shù)=增殖的芽總數(shù)/接種的外植體總數(shù)。

褐化程度采用目測法：“+”表示輕度褐化；“++”表示中度褐化；“+++”表示重度褐化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體的褐化現(xiàn)象 高山杜鵑在組織培養(yǎng)時用不同材料作為外植體其褐化程度不同。從圖1可以看出，用新生葉片作為外植體時，20d后完全褐變，褐化率為100%，褐化程度非常嚴(yán)重，培養(yǎng)基表面產(chǎn)生了一種褐色物質(zhì)；頂芽的褐變程度僅次之，其褐化率為73%；帶腋芽的幼嫩莖段褐化率為57%。接種后32d，頂芽褐化率上升至93%，帶腋芽的莖段的褐化率也增至80%。這是由于高山杜鵑新生葉片內(nèi)含有很多酚類化合物，接種前又進(jìn)行切割，傷口面積很大，培養(yǎng)過程中受傷細(xì)胞內(nèi)的多酚類物質(zhì)慢慢溢出，被氧化成褐色的醌類物質(zhì)，這些醌類物質(zhì)發(fā)生作用后使外植體蛋白質(zhì)聚合，導(dǎo)致其死亡[3]。頂芽比帶腋芽的莖段褐化率高，這可能是由頂芽中含有的大量的多酚類物質(zhì)和不同的內(nèi)源激素共同作用的結(jié)果[4]。

2.2 不同基本培養(yǎng)基對高山杜鵑褐變的影響 高山杜鵑帶腋芽的莖段在不同基本培養(yǎng)基上其褐化程度不同。從圖2可以看出，外植體在1/4MS培養(yǎng)基上褐化率最低。4d后每種培養(yǎng)基中都開始出現(xiàn)褐化，并且褐化程度逐漸增強(qiáng)。接種24d后，1/4MS培養(yǎng)基中的褐化率達(dá)63%，褐化程度較輕，并且產(chǎn)生了少量的叢生芽，而1/2MS培養(yǎng)基中褐化率為83%，Read培養(yǎng)基的褐化率達(dá)到了90%，MS培養(yǎng)基中褐化率也高達(dá)87%，外植體褐變程度較嚴(yán)重。接種后32d，Read和MS培養(yǎng)基的褐化率增至100%，1/2MS中增至97%，1/4MS為80%。由此看出，植物細(xì)胞的褐化受基本培養(yǎng)基影響較大，培養(yǎng)基中含有高濃度的無機(jī)鹽，誘導(dǎo)外植體中酚類化合物大量溢出，進(jìn)而加劇了外植體的褐化[5]。因此，降低培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度可以抑制酚類物質(zhì)的外溢，減緩褐變。

2.3 不同的抗褐化劑對高山杜鵑褐變的抑制作用 不同種類及不同濃度的抗褐化劑對高山杜鵑組織培養(yǎng)的抗褐化效果不同，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，活性炭（AC）對高山杜鵑外植體褐化有較強(qiáng)的抑制作用，在加入1.0g/LAC的培養(yǎng)基中褐化程度最輕。不加任何抗褐化劑時，32d后褐化率達(dá)到80%。添加0.5g/LAC的培養(yǎng)基中，其褐化率在32d后降至48%，褐變程度減輕，增殖系數(shù)為1.3。在添加1.0g/L活性炭時，32d后褐化率減至38%，褐化程度最輕，而且分化出了長勢良好的叢生芽，增殖系數(shù)為1.9。當(dāng)添加AC的濃度增加為1.5g/L時，在組織培養(yǎng)早期褐變程度相對較輕，然而培養(yǎng)32d后褐化率增加為45%，增殖系數(shù)減少為1.5，叢生芽生長減緩。這是由于AC吸附性很強(qiáng)，高濃度的AC在吸附醌類等有毒物質(zhì)的同時，也吸附了培養(yǎng)基的營養(yǎng)，從而阻礙了叢生芽的生長和分化[6]。AC能夠降低高山杜鵑組織培養(yǎng)的褐化率，但必須要選擇適宜的濃度。從表1還可以看出，培養(yǎng)基中添加了0.4～1.2g/LPVP，外植體褐變率達(dá)67%～75%，褐變程度稍有減輕，但增殖系數(shù)增加不明顯。本次實驗中PVP對高山杜鵑組培過程中褐變的抑制效果不顯著，這可能是由于PVP不能吸收高山杜鵑外植體中的一些多酚類物質(zhì)及其衍生物。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同外植體的褐化現(xiàn)象 高山杜鵑帶腋芽的莖段作為組織培養(yǎng)的外植體時褐化程度最輕；頂芽的褐化程度其次，新生葉片最嚴(yán)重，培養(yǎng)20d時褐化率即達(dá)100%。這可能與外植體的生長部位和面積有關(guān)。所以高山杜鵑組培快繁時盡量選用帶腋芽的幼嫩莖段。

3.2 不同基本培養(yǎng)基對高山杜鵑褐變的影響 實驗結(jié)果表明，高山杜鵑在MS培養(yǎng)基中褐變程度最嚴(yán)重，但在1/4MS培養(yǎng)基中褐化率最低。培養(yǎng)基中含有無機(jī)鹽濃度越高，外植體外溢的酚類物質(zhì)越多，褐化越嚴(yán)重。因此將培養(yǎng)基中無機(jī)鹽含量適度降低，能有效減輕高山杜鵑外植體的褐化程度。

3.3 不同的抗褐化劑對高山杜鵑褐變的抑制 在培養(yǎng)基中添加不同的抗褐化劑都能一定程度地減輕高山杜鵑外植體的褐變。其中，以加入AC時抑制作用較顯著，其濃度為1.0g/L時效果最佳，褐化率減為38%，增殖系數(shù)最大，新生芽長勢良好。而添加0.4～1.2g/LPVP對高山杜鵑褐化的抑制作用不明顯。

參考文獻(xiàn)

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[6]周艷，陳訓(xùn).活性炭在高山杜鵑組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（4）：30. （責(zé)編：張宏民）