商宏愷 仝進毅

[摘要] 目的 通過觀察羊胎盤糖皮質激素受體的變化，研究孕早期應用地塞米松對羊胎的影響。 方法 2005～2009年將108只羊隨機分為對照組（生理鹽水2 mL）和地塞米松組（地塞米松0.14 mg/kg肌注），應用免疫組化和western blot方法分析GR的表達。于孕50、100、125、140 d收集胎盤。 結果 在孕50 d和125 d的雌性羊胎，地塞米松增加了總GR蛋白表達量，但在孕125 d的雄性羊胎，地塞米松降低了總GR蛋白表達量。DEX沒有改變GRα蛋白表達量。根據GRα的表達發(fā)現(xiàn)三種雙核細胞亞型（++，+-，- -）。 結論 DEX對胎盤的作用是性別依賴的。DEX改變了胎盤對內源性糖皮質激素的反應。BNC的總體活力可能取決于三種亞型的分布比例。

[關鍵詞] 地塞米松；胎盤；糖皮質激素受體；雙核細胞；性別依賴

[中圖分類號] R715.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）33-0028-04

對有早產跡象的孕婦應用合成糖皮質激素能顯著降低新生兒死亡率和呼吸窘迫綜合征發(fā)生的可能性[1，2]。在孕早期，糖皮質激素還可以應用于先天性腎上腺皮質增生癥的治療[3]。雖然現(xiàn)在已經有很多關于孕晚期應用糖皮質激素的研究，但仍缺乏關于孕早期應用糖皮質激素的治療相關研究。雙核細胞（BNC）是羊胎盤滋養(yǎng)細胞中具有分泌功能的細胞，能夠分泌胎盤生乳素，從而對胎兒的生長發(fā)育起到重要作用[4]。糖皮質激素的作用需要通過糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）的介導[5]。GR有2個亞型，分別為GRα和GRβ。GRα是配體依賴性亞型，被認為是功能型受體，而GRβ為非配體依賴性，可能對GRα起到調節(jié)作用[6]。本研究觀察羊孕早期應用地塞米松對GR的分布和GR蛋白表達量的影響。我們假設糖皮質激素的作用是性別特異性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

所有實驗都經過倫理委員會的批準。在2005年1月～2009年12月期間懷有單胎的108只羊被分為對照組（n=59）和地塞米松組（DEX組，n=49）。對照組于孕50 d、100 d、125 d和140 d予2 mL的生理鹽水，DEX組則予0.14 mg/kg 的地塞米松（H02AB02，Mayne Pharma，Australia）肌注，每12小時一次，共4次。此后取出羊胎盤，并放入液氮中速凍保存，或放入福爾馬林溶液用于制作病理切片。

1.2 GRt、GRα和GRβ的定位

使用免疫組織化學染色GRt、GRα和GRβ。用兔抗人GRt抗體（MA1-510，Thermo Scientific，USA），濃度為1∶50或兔抗人GRα抗體（P-20：sc1002，Santa Cruz，USA），濃度為1∶100或兔抗人GRβ抗體（PA3-514，Thermo Scientific，USA），濃度為1∶100孵育24 h后，再用抗兔二抗（PK-4001 Vectastain ABC kit，Vector Laboratories，USA），濃度為1∶200孵育1 h。共設置3組陰性對照組：①僅使用一抗孵育；②僅使用二抗孵育；③僅用稀釋液孵育。

1.3 GRt、GRα和GRβ的蛋白定量

取80 mg胎盤組織放入裂解液中，在冰上用電動勻漿器充分勻漿，12000×g，4℃低溫離心15 min，收取蛋白。取80 μg蛋白加上5×上樣緩沖液煮沸10 min。在6%SDS-Page凝膠上進行電泳后濕轉至PVDF膜上，再用5%牛奶封閉1 h。將一抗稀釋（GRt 1∶1000，GRα 1∶200，GRβ 1∶200）過夜孵化；PBS-T漂洗后按1∶1000比例稀釋二抗，室溫孵育1 h。應用ECL發(fā)光液（32209，Thermo Scientific，USA）顯影后用凝膠成像儀成像。顯影完畢后，徹底沖洗，按之前步驟孵育多克隆β-actin一抗（107K4800，Sigma，USA）抗體濃度1∶20000，二抗使用HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶20000，31458，Thermo Scientific，USA），再次顯影、成像。使用Quantity One軟件分析灰度比值，從而得出GRt、GRα和GRβ的蛋白相對表達量。將GRt的電泳條帶切下后送專業(yè)公司進行蛋白結構分析。GRα和GRβ的蛋白特異性用公司配套的特異性阻斷劑檢驗（GRα阻斷劑：sc-1002 P，Thermo Scientific，USA；GRβ阻斷劑：PEP-222，Thermo Scientific，USA）。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件，正態(tài)分布變量以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

與之前研究結果相同，GRt和GRα分布于羊胎盤滋養(yǎng)細胞的細胞核與細胞質[7]。GR的分布不依賴于孕周、羊胎的性別以及是否給予地塞米松治療。未發(fā)現(xiàn)有GRβ分布于羊胎盤中。此外，GRα的免疫組化染色發(fā)現(xiàn)了三種新的雙核細胞亞型：兩個細胞核均表達GRα（++），兩個細胞核均不表達GRα（- -），一個細胞核表達GRα，另一個細胞核不表達GRα（+-）（封三圖4A、4B）。

使用Western Blot測定GRt的蛋白，可在97-kDa處探測到單一的條帶，將該條帶取出后進行蛋白測序證實為GRt（Genbank：EU371026.1）。在對照組中，羊胎為雄性的胎盤GRt蛋白表達量在孕125 d為最高，然后開始持續(xù)降低（圖1A）。而在羊胎為雌性的胎盤中GRt蛋白表達量在整個孕周無明顯變化。在孕50 d和孕125 d且羊胎為雌性的胎盤中，DEX組GRt蛋白表達量明顯高于對照組[孕50 d：（0.417±0.041） vs （0.887±0.235），P<0.05；孕125 d，（0.638±0.093） vs （1.070±0.152），P<0.05]。在孕125 d且羊胎為雄性的胎盤中，DEX組GRt蛋白表達量明顯低于對照組[（0.671±0.130） vs （1.127±0.118），P<0.05]。

使用Western Blot測定GRα的蛋白，可在95-kDa處探測到單一的條帶，該條帶能夠被GRα阻斷劑所抑制。在對照組的孕140 d，GRα的蛋白表達量最低（圖1B）。DEX沒有改變GRα的蛋白表達量，與先前的研究類似，使用Western Blot測定GRβ的蛋白，可在97-kDa處探測到單一的條帶，然而該條帶并不能被GRβ阻斷劑抑制。

3討論

孕早期應用DEX能夠對胎盤的發(fā)育和功能以及胎兒的生長產生一過性的影響，該影響因胎兒的性別而有所不同。在雌性胎兒的胎盤中，DEX能顯著增加孕中期（孕50和125 d）GRt蛋白表達量，但在雄性胎兒的胎盤中，DEX能顯著降低孕中期（孕125 d）GRt的表達量。GRα的蛋白表達量沒有受到DEX治療的影響。

糖皮質激素對GR的作用因不同的實驗方案和不同的實驗對象而有所不同[8-10]。在Hella S3系細胞中，給予DEX 24 h、48 h和2周后，均能顯著降低GR的mRNA表達量，而當清除DEX后，這種效果就不復存在[11]。若給予長達2年的慢性DEX刺激，GR的mRNA和蛋白表達量均無明顯變化[11]，提示治療時間的長短對于GR有不同的作用。在羊胎盤上的研究表明，將地塞米松直接注入到胎兒體內，會增高GRα的蛋白表達量，但卻不會改變GRt蛋白表達量[12]。此外，在人胎盤中，產前應用倍他米松沒有改變GRt和GRα的表達[13]。

在本研究中，按照孕周和胎兒性別分組，我們成功地檢測了各小組的GRt和GRα蛋白表達。在雌性胎兒的胎盤中，GRt蛋白量在整個孕周都無明顯變化，但在雄性胎兒的胎盤中，GRt蛋白表達在孕125 d最高，此后顯著下降。所有羊胎盤中，GRα蛋白表達量在孕140 d是最低的，其原因可能是接近分娩時的內源性皮質激素高峰對胎盤功能的抑制有關。在雌性胎兒中，早期應用DEX顯著增加了孕中期（孕50 d和孕125 d）GRt蛋白表達量，但在雄性胎兒中，DEX顯著降低孕中期（孕125 d）GRt蛋白表達量。這可能提示雌性胎兒更傾向于保持GC的敏感性，或許是為了保持生殖能力和種族延續(xù)，而雄性胎兒在遇到升高的GC時，選擇降低GC的敏感性。在既往的動物和人體研究中均曾發(fā)現(xiàn)這種性別依賴性改變，如早期給予DEX治療，會導致雌性胎兒的頂臀長和體重暫時的下降，增加胎盤中的細胞凋亡[14，15]；Saif等[16]發(fā)現(xiàn)在糖皮質激素調節(jié)路徑中，存在性別差異，同時臍血的糖皮質激素水平也有性別差異，提示雄性可能容易對糖皮質激素產生抵抗，而雌性則對糖皮質激素更敏感。

采用Gupta等[12]研究中所用的GRβ抗體，我們沒能檢測到胎盤中GRβ的表達，與Root等[17]的結果相同。在我們的研究中，97-kDa處的條帶顯示非常弱，并且不能被GRβ阻斷劑所抑制，因而我們認為在羊胎盤中，GRβ的表達量可能非常低，或者先前文章中提到的GRβ條帶其實是非特異性的。在最近的一項研究中，Saif等[16]在人胎盤中發(fā)現(xiàn)了12個GR亞型，這些亞型分布因不同的細胞、不同胎兒性別而有所不同，其中一些亞型不在每個人中都有分布。因此，我們的研究結果可能提示其他GR亞型也在羊胎盤中存在，這也能解釋為什么GRt蛋白發(fā)生了變化而GRα蛋白量卻未受到影響。

既往研究表明BNC的分布會影響OPL等蛋白的表達[18]。我們的研究根據是否表達GRα，可將BNC分為三種新的亞型。然而這三種亞型有什么不同的功能，目前還知之甚少。至今為止，人們普遍認為BNC可能是來自于一個單核細胞的特殊分裂形式（僅細胞核分裂而細胞質不分裂）[19，20]。但最近有研究報道，在人腦中BNC的形成來自于兩個單核細胞相互融合[21]。因此這三種不同形式的BNC可能代表了一個BNC的不同發(fā)育階段。我們假設（++）是一種“功能型”或“成熟的”BNC，（- -）是“無功能型”或是“未成熟型”BNC，而（+-）則是“中間型”BNC。而BNC的總體活性可能取決于這三種細胞的分布比例。

綜上所述，發(fā)現(xiàn)三種不同BNC亞型，三種亞型的分配比例可能決定了BNC的整體活性。我們的研究揭示了內源性GC和（或）外源性GC能通過GR對胎兒和胎盤發(fā)育造成影響。通過觀察糖皮質激素的治療對胎盤細胞功能的影響，我們的研究還為人們對胎盤應對外界變化中所處的角色研究提供了新的認識。

[參考文獻]

[1] Roberts D，Dalziel S. Antenatal corticosteroids for accelerating fetal lung maturation for women at risk of preterm birth[J]. The Cochrane Database of Systematic Reviews，2006， 3：CD004454.

[2] Liggins GC，Howie RN. A controlled trial of antepartum glucocorticoid treatment for prevention of the respiratory distress syndrome in premature infants[J]. Pediatrics，1972， 50（4）：515-525.

[3] Forest MG. Recent advances in the diagnosis and management of congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency[J]. Hum Reprod Update，2004，10（6）：469-485.

[4] Braun T，Meng W，Shang H，et al. Early dexamethasone treatment induces placental apoptosis in sheep[J]. Reproductive sciences，2015，22（1）：47-59.

[5] Nakagawa H，Groothuis DR，Owens ES，et al. Dexamethasone effects on vascular volume and tissue hematocrit in experimental RG-2 gliomas and adjacent brain[J]. Journal of Neuro-oncology，1988，6（2）：157-168.

[6] Funder JW.Mineralocorticoids，glucocorticoids，receptors and response elements[J]. Science，1993，259（5098）：1132-1133.

[7] Braun T，Li S，Moss TJ，et al. Maternal betamethasone administration reduces binucleate cell number and placental lactogen in sheep[J]. The Journal of endocrinology，2007， 194（2）：337-347.

[8] Lacroix A，Bonnard GD，Lippman ME. Modulation of glucocorticoid receptors by mitogenic stimuli，glucocorticoids and retinoids in normal human cultured T cells[J]. J Steroid Biochem，1984，21（1）：73-80.

[9] Cidlowski JA，Cidlowski NB. Regulation of glucocorticoid receptors by glucocorticoids in cultured Hela S3 cells[J].Endocrinology，1981，109（6）：1975-1982.

[10] Svec F，Rudis M. Glucocorticoids regulate the glucocorticoid receptor in the AtT-20 cel[J]. The Journal of biological chemistry，1981，256（12）：5984-5987.

[11] Silva CM，Powell-Oliver FE，Jewell CM，et al. Regulation of the human glucocorticoid receptor by long-term and chronic treatment with glucocorticoid[J]. Steroids，1994， 59（7）：436-442.

[12] Gupta S GS，Lye SJ，Gibb W，et al. Effect of labor on glucocorticoid receptor （GRTotal，GRα，and GRβ）proteins in ovine intrauterine tissues[J]. Journal of the Society for Gynecologic Investigation ，2003，10（3）：136-144.

[13] Johnstone JF，Bocking AD，Unlugedik E，et al. The effects of chorioamnionitis and betamethasone on 11beta hydroxysteroid dehydrogenase types 1 and 2 and the glucocorticoid receptor in preterm human placenta[J]. Journal of the Society for Gynecologic Investigation，2005，12（4）：238-245.

[14] Braun T，Li S，Sloboda DM，et al. Effects of maternal dexamethasone treatment in early pregnancy on pituitary-adrenal axis in fetal sheep[J]. Endocrinology，2009，150（12）：5466-5477.

[15] Li S，Sloboda DM，Moss TJ，et al. Effects of glucocorticoid treatment given in early or late gestation on growth and development in sheep[J]. Journal of developmental origins of health and disease，2013，4（2）：146-156.

[16] Saif Z，Hodyl NA，Hobbs E，et al. The human placenta expresses multiple glucocorticoid receptor isoforms that are altered by fetal sex，growth restriction and maternal asthma[J]. Placenta，2014，35（4）：260-268.

[17] Root B，Abrassart J，Myers DA，et al. Expression and distribution of glucocorticoid receptors in the ovine fetal adrenal cortex：effect of long-term hypoxia[J]. Reproductive sciences，2008，15（5）：517-528.

[18] Wooding FBP，Morgan G，Monaghan S，et al. Functional specialization in the ruminant placenta： Evidence for two populations of fetal binucleate cells of different selective synthetic capacity[J]. Placenta，1996，17（1）：75-86.

[19] Sibley CP，Birdsey TJ，Brownbill P，et al. Mechanisms of maternofetal exchange across the human placenta[J]. Biochemical Society transactions，1998，26（2）：86-91.

[20] Snoeck J. The physiology of the human placenta[J]. Triangulo，1962，（5）：180-190.

[21] Kemp K，Gray E，Wilkins A，et al. Purkinje cell fusion and binucleate heterokaryon formation in multiple sclerosis cerebellum[J]. Brain：A Journal of Neurology，2012， 135（10）：2962-2972.

（收稿日期：2015-10-09）