王繼文 王立志閆天海 郭 偉 徐 琴（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，雅安625014）

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山羊瘤胃與糞便微生物多樣性

王繼文 王立志?閆天海 郭 偉 徐 琴
（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，雅安625014）

摘 要：本試驗(yàn)旨在應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)比較山羊瘤胃和糞便微生物的結(jié)構(gòu)與組成。選取6 只10月齡波爾山羊，飼喂精粗比為3∶7的飼糧14 d后采集瘤胃液（R組）和糞便樣品（F組）（每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣品為1個(gè)重復(fù)）。提取總DNA后用古菌／細(xì)菌16S rRNA通用引物擴(kuò)增V4～V5區(qū)，并用Illumina MiSeq平臺(tái)測(cè)序。結(jié)果表明：1）共獲得有效序列227 729條，聚類后得13 601個(gè)運(yùn)算分類單位（OTU）。2）所得OTU經(jīng)物種注釋99．337%被歸類為細(xì)菌界，F(xiàn)組相對(duì)豐度最高優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門（65．400%），R組相對(duì)豐度最高優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門（60．188%）。3）從所有樣品中共檢測(cè)到129個(gè)科，F(xiàn)組中相對(duì)豐度最高為瘤胃球菌科（37．705%），極顯著高于R組（P＜0．01），而R組中，相對(duì)豐度最高的為普雷沃氏菌科（29．959%），極顯著高于F組（P＜0．01）。4）在糞便樣品和瘤胃液樣品種共檢測(cè)到258個(gè)屬，F(xiàn)組相對(duì)豐度最高的屬為瘤胃球菌科未分類的屬（26．914%），R組相對(duì)豐度最高為普雷沃菌屬（28．621%）。5）所有12個(gè)樣品間共發(fā)現(xiàn)了14個(gè)共享屬，其中相對(duì)豐度最高的為厚壁菌門下的梭菌屬4（Clostridium＿Ⅳ，1．748%）。本試驗(yàn)結(jié)果表明瘤胃和糞便中微生物組成存在著較大差異，瘤胃中還有許多未被分類鑒定且相對(duì)豐度較高的微生物，需要進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：山羊；Illumina MiSeq；瘤胃；糞便；微生物

良好的胃腸道功能對(duì)于維持反芻動(dòng)物的健康、保證生產(chǎn)潛能的發(fā)揮至關(guān)重要。微生物群落是維系胃腸道正常功能的一個(gè)重要組分，反芻動(dòng)物胃腸道的微生態(tài)平衡與宿主的健康［1］和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收［2］息息相關(guān)，特別是瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)可以幫助宿主消化飼糧中纖維、淀粉、蛋白質(zhì)等養(yǎng)分。因此，人們常通過檢測(cè)瘤胃微生物的結(jié)構(gòu)與組成評(píng)估宿主的健康和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。目前獲取瘤胃內(nèi)容物樣品主要采用胃管采集、瘤胃穿刺、安裝瘤胃瘺管等方法，對(duì)于放養(yǎng)的反芻動(dòng)物此類方法顯然不適用。此外，這些方法會(huì)給動(dòng)物造成一定的生理傷害，且安裝瘺管成本較高，同時(shí)這些方法受到動(dòng)物福利相關(guān)規(guī)定的限制。而糞便樣品易采集，有研究表明無論用瘤胃內(nèi)容物還是新鮮糞便進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)，各種飼料的消化率與其在體內(nèi)的消化率都呈正相關(guān)［3］，這也說明研究糞便微生物具有一定意義，而用糞便代替瘤胃內(nèi)容物來測(cè)定飼料消化率的可行性很大程度上取決于微生物群落。關(guān)于反芻動(dòng)物糞便和瘤胃微生物群落的研究報(bào)道相對(duì)較多，但以往這些研究主要采用的是傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)［4］以及以克?。瘻y(cè)序?yàn)橹饕侄蔚姆肿由飳W(xué)技術(shù)［5］。培養(yǎng)技術(shù)僅能研究體外可生長(zhǎng)的微生物［6］，這部分微生物僅占胃腸道微生物的1%左右［7］，那些能在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的微生物，其重要性會(huì)被過高估計(jì)，且克?。瘻y(cè)序技術(shù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力分辨率低［8］。高通量測(cè)序（high?through?put sequencing）技術(shù)是一種研究微生物生態(tài)學(xué)的全新技術(shù)手段，能全面地反應(yīng)樣品微生物的結(jié)構(gòu)與組成［8］。目前，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)研究反芻動(dòng)物瘤胃和糞便微生物的報(bào)道主要是有關(guān)牛的［9－11］，缺乏有關(guān)山羊瘤胃和糞便微生物的研究。因此，本試驗(yàn)旨在應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)研究山羊瘤胃和糞便微生物結(jié)構(gòu)與組成，并對(duì)比二者之間的差異。

1　材料與方法

1．1 試驗(yàn)動(dòng)物和飼糧

試驗(yàn)動(dòng)物為6只健康已閹割的波爾山羊，均為10月齡，平均體重為（20．00±1．51）kg。飼糧精粗比為3∶7，單籠飼養(yǎng)，自由飲水，每日定時(shí)飼喂2次（10：00和16：00），飼喂量按體重4%供給，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。飼糧營(yíng)養(yǎng)水平測(cè)定參考張麗英［12］的方法進(jìn)行。

1．2 樣品采集與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

穩(wěn)定飼喂飼糧14 d后，在第15天晨飼前采集每只羊的瘤胃液和糞便樣品，分記作R組和F組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣品為1個(gè)重復(fù)。瘤胃液采集方法：將10 mm直徑塑料管連接到一個(gè)真空泵，用開口器打開羊的口腔，將塑料管從羊口腔緩慢插入，直至瘤胃，抽取瘤胃內(nèi)容物約50 mL裝入充滿氮?dú)獾臉悠反?，置于冰上。反?fù)拍打樣品袋以確保固相微生物充分進(jìn)入液相，然后用4層紗布過濾得到瘤胃液，編號(hào)分裝后迅速投入液氮中保存；糞便采集方法：手戴一次性無菌手套，將食指伸入肛門，在直腸處掏取直腸糞便約20 g，編號(hào)分裝后迅速投入液氮中保存。所有樣品立即帶回實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存，備用。

表1　飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1　Composition and nutrient levels of the diet（air?dry basis）　%

1．3 DNA提取

取200 mg糞便或瘤胃液樣品于5 mL離心管中，加入1 mL ASL緩沖液，振蕩混勻，用QIAam?pH DNA提取試劑盒（Qiagen，德國(guó)）提取樣品總DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。為提高DNA獲得率，在步驟1中需加入0．5 g皓微珠。提取的總DNA于－20℃保存，備用。

1．4 16S rRNA的PCR擴(kuò)增和Illumina MiSeq測(cè)序

以樣品中菌群總DNA為模板，用古菌／細(xì)菌通用引物，針對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V4～V5區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物為：515F（5′－GTGYCAGC?MGCCGCGGTAA－3′）和806R（5′－GGACTAC? CAGGGTATCTAAT－3′）［13］。PCR采用20 μL反應(yīng)體系，包括0．4 μL FastPfu Polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司），4 μL 5×FastPfu Buffer，引物濃度均為5 μmol／L，各0．4 μL，2．5 mmol／L dNTP 2 μL，總DNA 10 ng，補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR過程在ABI Gene Amp 9700上進(jìn)行，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min；隨后變性循環(huán)30次（95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s為1個(gè)循環(huán)）；72℃延伸5 min，10℃冷卻。PCR產(chǎn)物用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并用PCR純化試劑盒（Qiagen，德國(guó)）純化和回收，回收的PCR產(chǎn)物用QuantiFlourTM?ST fluorometer［普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司）］定量，并按測(cè)序要求進(jìn)行混合。然后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1．5 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)以Fastq文件格式保存，首先利用QIIME 1．8．0軟件［14］對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初次質(zhì)控，去除序列平均堿基質(zhì)量值＜Q20、未知堿基數(shù)＞6及同聚物太大的序列，只保留240～500 bp長(zhǎng)度的序列。去除Barcode和引物序列，然后在Mothur［15］軟件中拼接質(zhì)控后的序列；再在QIIME軟件中，使用Uclust法［16］將序列按照97%相似性進(jìn)行聚類運(yùn)算分類單位（operational taxonomic units，OTU），并挑選每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為代表序列。繼而采用PyNAST法［17］，將所有代表序列與Greengenes參考數(shù)據(jù)庫（http：／／greengenes．lbl．gov／）進(jìn)行序列比對(duì)，并使用RDP分類器［18］對(duì)代表序列從門到屬進(jìn)行物種注釋，并構(gòu)建OTU表。繼而分別剔除rep＿set．fasta、OTU table和rep＿set．tree中的嵌合體和Singletons。對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行α多樣性分析，計(jì)算樣品間Shannon?Wiener指數(shù)、ChaoⅠ指數(shù)、The＿observed＿species及PD＿whole＿tree指數(shù)，并進(jìn)行差異顯著性分析（采用SPSS 18．0軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)）。結(jié)合各個(gè)樣品的OTU種類及其豐度進(jìn)行計(jì)算，獲得樣品間Unweighted Unifrac距離矩陣，并利用非加權(quán)組平均法（UPG?MA）進(jìn)行聚類分析，然后用MEGA5．0軟件繪制PCoA聚類圖。組間各菌群相對(duì)豐度差異顯著性分析采用SPSS 18．0軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果與分析

2．1 樣品測(cè)序深度和α多樣性分析

本次試驗(yàn)共獲得227 729條有效序列（clean data），平均每個(gè)樣品含有（18 977±5 569）條序列。基于相似度大于97%的原則，將獲得的有效序列進(jìn)行OTU聚類，共獲得13 601個(gè)OTU，其中F組8 382個(gè)，R組5 777個(gè)，2組間共享的OTU為558個(gè)（圖1）。不考慮處理效應(yīng)，每個(gè)樣品OTU平均值為（1 927±735）個(gè)，其中F組OTU平均值為（2 197±862）個(gè)，R組OUT平均值為（1 658±520）個(gè)，組間差異不顯著（P＞0．05）。

樣品的稀釋曲線見圖2。由圖2可見，在本試驗(yàn)的測(cè)序深度下，除了樣品F3、F4，其余各樣品稀疏曲線最終均趨于平緩，說明本試驗(yàn)的測(cè)序量可以覆蓋各樣品的大多數(shù)微生物。

圖1　OTU維恩圖Fig．1　OTU venn diagram

在取樣深度為10 200時(shí)，比較糞便和瘤胃的α多樣性指數(shù)可知，ChaoⅠ、The＿observed＿species、PD＿whole＿tree和Shannon?Wiener指數(shù)組間差異均不顯著（P＞0．05）（表2）。

2．2 不同分類水平上的物種組成分析

將本試驗(yàn)所得有效序列在不同分類水平上進(jìn)行物種注釋和統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，在界水平上，古菌占0．220%，未分類微生物占0．443%，而細(xì)菌（bac?teria）的相對(duì)豐度最高，達(dá)到99．337%。各樣品在門水平上的物種組成見圖3，2組樣品在古菌界下均只檢測(cè)到一個(gè)門———廣古菌門（Euryarchaeota），F(xiàn)組廣古菌門的相對(duì)豐度為（0．130±0．033）%，而R組為（0．309±0．143）%。在細(xì)菌界中，F(xiàn)組共檢測(cè)到17個(gè)門，而R組為21個(gè)門。其中，F(xiàn)組相對(duì)豐度最高的4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門從高到低依次分別為：厚壁菌門［Firmicutes，（65．400±8．090）%］、擬桿菌門［Bacteroidetes，（26．620±5．303）%］、變形菌門［Proteobacteria，（3．047±2．103）%］、未分類的細(xì)菌［（1．228±0．549）%］，而R組為擬桿菌門［（60．188±4．864）%］、厚壁菌門［（21．674± 5．118）%］、變形菌門［（5．827±2．312）%］和未分類的細(xì)菌［（4．649±3．385）%］。

在科水平上對(duì)比糞便和瘤胃液的物種組成，從所有12個(gè)樣品中共檢測(cè)到129個(gè)科，其中F組100個(gè)，R組105個(gè)。組間相對(duì)豐度差異達(dá)顯著水平（P＜0．05）的共有22個(gè)科，差異極顯著（P＜0．01）的有10個(gè)科，詳見表3。組間差異顯著或極顯著的科中，F(xiàn)組相對(duì)豐度最高的科為厚壁菌門下的瘤胃球菌科（Ruminococcaceae），其相對(duì)豐度高達(dá)37．705%，極顯著高于R組（P＜0．01），其次為厚壁菌門下的毛螺旋菌科（Lachnospiraceae，13．802%），顯著高于R組（P＜0．05）；R組中，相對(duì)豐度最高的為擬桿菌門下的普雷沃氏菌科（Prevo?tellaceae，29．959%），極顯著高于F組（P＜0．01），其次為擬桿菌門下未分類的擬桿菌門（11．375%），顯著高于F組（P＜0．05）。

圖2　樣品稀釋曲線Fig．2　Rarefaction curves of samples

所有樣品共檢測(cè)到258個(gè)屬，表4分別列出F組和R組相對(duì)豐度最高的20個(gè)屬。其中F組有12個(gè)屬于厚壁菌門，5個(gè)屬于擬桿菌門，屬于變形菌門、未分類細(xì)菌、纖維桿菌門的各有1個(gè)；R組有8個(gè)屬于厚壁菌門，4個(gè)屬于擬桿菌門，4屬于變形菌門，屬于未分類細(xì)菌、軟壁菌門（Tenericutes）、黏膠球形菌門（Lentisphaerae）、疣微菌門（Verrucomi?crobia）的各有1個(gè)。F組相對(duì)豐度大于1%的屬有18個(gè)，而R組有15個(gè)。F組相對(duì)豐度最高的3個(gè)屬分別為厚壁菌門瘤胃球菌科未分類的屬［（26．914±5．639）%］、擬桿菌門的擬桿菌屬［Bac?teroides，（11．252±4．244）%］、厚壁菌門毛螺菌科未分類的屬［（10．128±4．548）%］；R組相對(duì)豐度最高的3個(gè)屬均源于擬桿菌門，分別為普雷沃菌屬［Prevotella，（28．621±8．389）%］、擬桿菌門未分類的屬［（11．375±6．476）%］、擬桿菌目未分類的屬［（11．299±4．132）%］。

表2　取樣深度為10 200時(shí)，瘤胃和糞便微生物α多樣性指數(shù)對(duì)比Table 2　Comparison of α diversity indices of microbial communities between rumen and feces calculated at a sample depth of 10 200

圖3　門水平上菌群組成Fig．3　Composition of microbial community at phylum level

表3　瘤胃和糞便差異顯著和極顯著的科Table 3　The families that were significantly different or extremely significantly different between rumen and feces（n＝6）　%

表4　糞便和瘤胃中序列相對(duì)豐度最高的20個(gè)屬Table 4　Twenty genera with the highest sequence relative abundance in rumen and feces（n＝6）　%

2．3 PCoA聚類分析

結(jié)合樣本的OTU的種類及其相對(duì)豐度，計(jì)算樣本間加權(quán)遺傳距離矩陣（weighted unifrac dis?tance），利用距離矩陣?yán)L制PCoA聚類圖，分析其組間相似性（圖4）。結(jié)果表明，F(xiàn)組與R組間相似性為（36．61±4．88）%。各樣品依據(jù)所處組別的不同而相互聚類到一起，表明組內(nèi)相似性比組間相似度高。此外，F(xiàn)組個(gè)體的聚集程度比R組高，說明F組組內(nèi)的相似度高于R組。

圖4　PCoA聚類分析Fig．4　Cluster analysis by principal co?ordinate analysis

2．4 共享屬分析

F組和R組組內(nèi)及組間的共享屬見表5。在F組內(nèi)共發(fā)現(xiàn)了22個(gè)共享屬，共來源于7個(gè)門，其中13個(gè)屬源于厚壁菌門，擬桿菌屬［（11．252± 4．244）%］為其相對(duì)豐度最高的共享屬；R組內(nèi)共發(fā)現(xiàn)了30個(gè)共享屬，共來源于12個(gè)門，其中有12個(gè)屬源于厚壁菌門，普雷沃菌屬［（28．621± 8．389）%］為其相對(duì)豐度最高的共享屬。所有12個(gè)樣品間共發(fā)現(xiàn)了14個(gè)共享屬，其中有9個(gè)屬于厚壁菌門，1個(gè)屬于古菌界廣古菌門，其他4個(gè)分別屬于不同的門，相對(duì)豐度最高的為厚壁菌門的梭菌屬4［Clostridium＿Ⅳ，（1．748±1．330）%］。

3　討 論

反芻動(dòng)物胃腸道微生物可幫助宿主從飼料中獲取養(yǎng)分，并抵御病原微生物感染，其瘤胃和糞便微生物的結(jié)構(gòu)與組成常被用于評(píng)估宿主的健康狀況［19－22］。目前，有關(guān)利用高通量測(cè)序技術(shù)研究山羊瘤胃和糞便微生物的報(bào)道較少［23－24］，有關(guān)二者組成和結(jié)構(gòu)差異的研究還未見報(bào)道。為使人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)山羊胃腸道微生物，本試驗(yàn)用高通量測(cè)序技術(shù)研究了山羊瘤胃和糞便微生物的物種組成及其豐度，并比較了兩者的差異。

Kim等［25］對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫中的所有可利用瘤胃微生物序列進(jìn)行了總結(jié)，結(jié)果表明瘤胃相對(duì)豐度最高的微生物為厚壁菌門，其次為擬桿菌門。但本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，山羊瘤胃中相對(duì)豐度最高的是擬桿菌門，其次為厚壁菌門。出現(xiàn)該差異可能是因?yàn)闄z測(cè)方法不同，本試驗(yàn)所采用的為高通量測(cè)序技術(shù)，而Kim等［25］所總結(jié)的序列主要是通過變性梯度凝膠電泳、限制酶切片段多態(tài)性等技術(shù)得到的；此外，也可能是因?yàn)镵im等［25］所研究的對(duì)象主要為牛和綿羊的瘤胃微生物序列，與山羊瘤胃微生物序列存在一定的種間差異。除了研究方法、動(dòng)物品種，飼糧和日齡的不同也會(huì)影響瘤胃微生物［23，26］。Huo等［23］利用高通量測(cè)序法研究山羊瘤胃微生物時(shí)發(fā)現(xiàn)，飼喂高粗料飼糧條件下瘤胃固相微生物中擬桿菌門豐度最高，液相微生物中擬桿菌門和厚壁菌門豐度相當(dāng)，但飼喂高精料飼糧時(shí)無論是瘤胃固相微生物還是液相微生物，相對(duì)豐度最高的門均為厚壁菌門。Jami等［26］發(fā)現(xiàn)1～3日齡的奶牛犢牛瘤胃中豐度從高到低依次為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，但隨著年齡的增長(zhǎng)，2、6以及24月齡牛瘤胃中，擬桿菌門相對(duì)豐度均超過50%。

在屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)山羊瘤胃液中相對(duì)豐度最高的菌屬為普雷沃菌屬。這與以往在其他反芻動(dòng)物如奶牛［27］、肉牛［11］和綿羊［28］上的研究結(jié)果一致，這可能意味著普雷沃菌屬為所有反芻動(dòng)物瘤胃微生物的優(yōu)勢(shì)菌屬。普雷沃菌屬能在瘤胃中處于優(yōu)勢(shì)地位，可能與該屬微生物種型多，遺傳多樣性豐富，底物寬泛等因素有關(guān)。目前可分離培養(yǎng)的普雷沃菌屬有棲瘤胃普雷沃菌（Prevotel?la ruminicola）、短普雷沃氏菌（Prevotella brevis）、布氏普雷沃氏菌（Prevotella bryantii）和Prevotella albensis［29］。其中，棲瘤胃普雷沃菌和布氏普雷沃氏菌均有降解寡糖、蛋白質(zhì)、淀粉、木聚糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力［30］；大部分可分離培養(yǎng)的短普雷沃氏菌能夠發(fā)酵纖維二糖、果糖、葡萄糖、菊糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、蜜二糖、蜜三糖、蔗糖、多肽［29］；有研究表明大多數(shù)可分離培養(yǎng)的Prevotella albensis能夠發(fā)酵葡萄糖、木糖、水楊苷和多肽，此外還能產(chǎn)生很弱的木羧甲基纖維素酶活性［29］。由此可見，除脂質(zhì)外，普雷沃菌屬幾乎可以單獨(dú)完成或參與瘤胃內(nèi)所有飼糧成分的降解，因此其在瘤胃生態(tài)中扮演著重要角色。基于培養(yǎng)和非培養(yǎng)的分子技術(shù)方法的研究表明，普雷沃菌屬在山羊瘤胃的相對(duì)豐度分別為60%和56%［28］。但可能由于研究技術(shù)不同，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)瘤胃液中普雷沃氏菌的相對(duì)豐度為28．621%，數(shù)值上低于前人的研究結(jié)果。

表5　瘤胃和糞便或所有樣品的共享屬Table 5　The shared genera between rumen and feces or all samples

續(xù)表5

瘤胃球菌屬以往被認(rèn)為在瘤胃降解飼料養(yǎng)分中發(fā)揮著重要作用，因?yàn)樵搶俸?種功能強(qiáng)大的纖維降解菌———白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）和黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefa?ciens），這2種菌能夠產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶［31－32］，是瘤胃中主要的纖維降解菌。但本研究發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌屬在瘤胃中豐度僅有0．669%，Girija等［33］關(guān)于牛瘤胃微生物的研究也表明瘤胃球菌屬豐度僅有2%，表明瘤胃球菌屬在瘤胃中僅占很小的比例。這說明以往依靠傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)得到的試驗(yàn)結(jié)果，可能嚴(yán)重夸大了瘤胃球菌屬在瘤胃中的作用。

本研究結(jié)果表明，山羊糞便中相對(duì)豐度最高的微生物為厚壁菌門（65．400%），其次為擬桿菌門（26．620%）、變形菌門（3．047%），這與前人用高通量測(cè)序方法研究牛糞便微生物組成的結(jié)果相一致［11］。De Jesùs?Laboy等［34］利用基因芯片技術(shù)研究了圈養(yǎng)山羊和野山羊糞便的微生物組成，發(fā)現(xiàn)相對(duì)豐度排在前2位的也是厚壁菌門和擬桿菌門，而排在第3位的為放線菌門，與本試驗(yàn)的結(jié)果稍有差異。但Min等［24］的研究卻發(fā)現(xiàn)，山羊糞便中相對(duì)豐度最高的為變形菌門，擬桿菌門和厚壁菌分別位于第2和3位，這與本研究結(jié)果差異較大，這可能與試驗(yàn)動(dòng)物品種、試驗(yàn)動(dòng)物飼糧、試驗(yàn)條件等綜合因素有關(guān)。本試驗(yàn)得出，在屬水平上山羊糞便相對(duì)豐度最高的為瘤胃球菌科未分類的屬。Gu等［35］利用高通量測(cè)序技術(shù)研究小鼠胃腸道各個(gè)部位的微生物多樣性，結(jié)果表明瘤胃球菌科是小鼠大腸以及糞便中的優(yōu)勢(shì)菌群，且其在糞便中的相對(duì)豐度高于其他胃腸道部位。這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致，本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌科在山羊糞便中的豐度極顯著高于瘤胃。瘤胃球菌科中有些菌種已被培養(yǎng)鑒定，有的已被全基因測(cè)序，這些菌種被證明能夠產(chǎn)生纖維素酶、淀粉酶等碳水化合物降解酶［36］，說明瘤胃球菌科微生物具有廣泛的碳水化合物降解活性。其在糞便中相對(duì)豐度較高可能表明山羊后腸碳水化合物的發(fā)酵很活躍，但也有可能與動(dòng)物體內(nèi)炎癥有關(guān)，因?yàn)榱鑫盖蚓频囊恍┓N類是促炎癥細(xì)菌，據(jù)報(bào)道其在發(fā)炎性腸道疾病的病人體內(nèi)有很高的豐度［37］。此外，瘤胃球菌科的部分菌可參與不飽和脂肪酸的生物氫化作用［38］，有的能夠降解芳香族化合物、肉桂酸和巴豆酸酯［39］。

本試驗(yàn)將所得有效序列進(jìn)行OTU聚類后，共獲得13 601個(gè)OUT，但糞便和瘤胃液共享的OUT僅有558個(gè)，僅占OUT總數(shù)的4．1%，這說明山羊糞便和瘤胃微生物的菌群結(jié)構(gòu)差異較大。比較2組的α多樣性指數(shù)，雖然反映樣品中物種豐富度（richness）和／或均勻度（eveness）的ChaoⅠ、The＿observed＿species、PD＿whole＿tree和Shannon?Wie?ner指數(shù)組間差異均不顯著，但在數(shù)值上，F(xiàn)組的各項(xiàng)指數(shù)都大于R組，說明山羊糞便微生物的多樣性高于瘤胃微生物，而差異不顯著可能是由于組內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差過大。在科水平上，F(xiàn)組和R組組間差異顯著的微生物共有22個(gè)科，差異極顯著的微生物有10個(gè)科。在屬水平上，F(xiàn)組和R組相對(duì)豐度最高的共享屬都屬于擬桿菌門，分別為擬桿菌屬和普雷沃菌屬。但擬桿菌屬不是R組共享屬，普雷沃菌屬也是F組的共享屬。飼料纖維絕大部分都在瘤胃中被降解，許多已知在纖維分解中有重要作用的屬如丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、纖維桿菌屬（Fibrobacter），以及降解半纖維素的屬如琥珀酸弧菌屬（Succinivibrio）、螺旋體屬（Spirochaeta）、密螺旋體屬（Treponema）僅為R組的共享屬。而F組部分樣本也可檢測(cè)到少量纖維降解菌，主要是因?yàn)楹竽c段存在一定的纖維發(fā)酵活動(dòng)。

瘤胃微生物主要可分為固相微生物和液相微生物，液相微生物存在于瘤胃液中，而固相微生物主要疏松或緊密附著在飼料顆粒表面或存在于飼料顆粒內(nèi)部，在糞便瘤胃固相和液相微生物不再存在。De Oliveira等［11］用454焦磷酸測(cè)序方法研究了閹牛不同胃腸道部位的微生物分布以及發(fā)育規(guī)律，結(jié)果表明，糞便與結(jié)腸微生物組成最接近，而與瘤胃差異最大，瘤胃與糞便微生物共享OTU僅有66個(gè)。Frey等［40］也報(bào)道，當(dāng)食糜從胃腸道的一個(gè)部位進(jìn)入另一個(gè)部位時(shí)，其內(nèi)的微生物會(huì)發(fā)生顯著變化。從本試驗(yàn)結(jié)果中也可知，相比于瘤胃，糞便微生物菌群分布變化很大。這主要是因?yàn)榱鑫肝⑸镫S食糜流向小腸時(shí)，腸道內(nèi)酸性環(huán)境使得微生物細(xì)胞被溶解，微生物蛋白質(zhì)連同飼料非降解蛋白質(zhì)組成小腸蛋白質(zhì)，供宿主吸收利用［41］。因此，到達(dá)后腸的瘤胃微生物很少。糞便菌群結(jié)構(gòu)與瘤胃相比有較大變化也可能與食糜在后腸的停留時(shí)間較短有關(guān)，且一些微生物生長(zhǎng)需要特定的生長(zhǎng)環(huán)境［42］。瘤胃內(nèi)古菌主要以產(chǎn)甲烷菌為主，產(chǎn)甲烷菌雖然數(shù)量遠(yuǎn)小于細(xì)菌，但其能利用瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的氫氣將二氧化碳還原最終生成甲烷，該過程會(huì)消耗2%～15%的飼料總能。瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌最主要的種類為甲烷短桿菌（Metha?nobrevibacter），本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在所有瘤胃和糞便古菌種類中，甲烷短桿菌的相對(duì)豐度均為最高，且在所有糞便和瘤胃樣品中均被檢測(cè)到。瘤胃甲烷短桿菌屬的相對(duì)豐度為0．072%，占瘤胃所有古菌的23%；糞便甲烷短桿菌屬的相對(duì)豐度為0．075%，但其占糞便所有古菌的比例達(dá)到58%。這說明后腸中也存在一定數(shù)量的產(chǎn)甲烷菌，雖然糞便中古菌數(shù)量有所減少，但甲烷短桿菌屬的相對(duì)豐度并未有較大變化。這預(yù)示著也許可通過檢測(cè)糞便中的產(chǎn)甲烷菌（特別是甲烷短桿菌屬）來反映瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌的結(jié)構(gòu)與組成、評(píng)估反芻動(dòng)物的產(chǎn)甲烷能力或預(yù)測(cè)反芻動(dòng)物的甲烷產(chǎn)量，而這需要更多研究來進(jìn)一步確定二者之間的關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)糞便和瘤胃中未分類的微生物相對(duì)豐度均大于1%，且各個(gè)分類水平上均發(fā)現(xiàn)較多未能被分類的微生物，這表明在瘤胃和糞便中還有許多微生物未被人們所清楚認(rèn)識(shí)，而這些微生物可能在動(dòng)物生理活動(dòng)中扮演者舉足輕重的作用，有待深入研究。

4　結(jié) 論

①瘤胃內(nèi)容物及糞便中的微生物群落存在較大的差異，瘤胃微生物主要以擬桿菌門為主，厚壁菌門次之，相對(duì)豐度最高的屬為普雷沃菌屬；而糞便中的微生物以厚壁菌門為主，擬桿菌門次之，相對(duì)豐度最高的屬為瘤胃球菌科下未分類的屬。

②瘤胃中還有許多未被分類鑒定且相對(duì)豐度較高的微生物，其結(jié)構(gòu)和功能有待深入研究。

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Diversity of Ruminal and Fecal Microbiota of Goat

WANG Jiwen WANG Lizhi

?

YAN Tianhai GUO Wei XU Qin

（Animal Nutrition Institute，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

?Corresponding author，professor，E?mail：wanglizhi＠aliyun．com

Abstract：This experiment was conducted to explore structure and composition of ruminal and fecal microbiota of goat．Six ten?month?old Boer goats were fed a diet consisting of 30%concentrate and 70%roughage．After 14?day experiment，the rumen fluid（R group）and feces（F group）were sampled［each group had 3 repli?cates（samples）］．Total DNA of rumen content and feces samples were extracted，and universal prokaryote primers were used to target the V4 to V5 hypervariable region of 16S rRNA，finally the products were se?quenced on MiSeq Illumina sequencing platform．The results showed as follows：1）a total of 227 729 se?quences across all rumen content and fecal samples were generated，and the total number of operational taxo?nomic units（OTUs）detected by the cluster analysis reached 13 601．2）The 99．337%of all OTUs belonged to bacteria．The most abundant phyla in F and R groups was Firmicutes（65．400%）and Bacteroidetes （60．188%），respectively．3）One hundred and twenty nine families were detected in all samples．The most a?bundant families found in F group was Ruminococcaceae（37．705%），which was extremely significantly high?er than that in R group（P＜0．01）；the most abundant families found in R group was Prevotellaceae （29．959%），which was extremely significantly higher than that in F group（P＜0．01）．4）Two hundred and twenty nine genera were detected in all samples．The most abundant genus found in F and R groups was unclas?sified Ruminococcaceae（26．914%）and Prevotella（28．621%），respectively．5）The analysis revealed 14 genera shared by all 12 samples．Among them，the most abundant genus was Clostridium＿Ⅳ（1．748%）．It is concluded that there is a significant difference between ruminal and fecal microbiota，and there are many un?classified microbiomes that have high relative abundance in the rumen，which need further investigations．［Chi?nese Journal of Animal Nutrition，2015，27（8）：2559?2571］

Key words：goat；Illumina MiSeq；rumen；feces；microorganism

通信作者：?王立志，副教授，碩士生導(dǎo)師，E?mail：wanglizhi＠aliyun．com

作者簡(jiǎn)介：王繼文（1991—），男，四川米易人，碩士研究生，從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究。E?mail：lessonzilang＠163．com

基金項(xiàng)目：四川省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目“畜禽溫室氣體排放量檢測(cè)及減排技術(shù)研究”（2013HH0043）

收稿日期：2015－02－02

doi：10．3969／j．issn．1006?267x．2015．08．030

文章編號(hào)：1006?267X（2015）08?2559?13

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：S826