嚴(yán)小明　連福明　林智勤　張維

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬三明第一醫(yī)院骨科， 福建 三明 365000;2.成都醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院， 四川 成都 610500)

苦參堿通過(guò)下調(diào)STAT3信號(hào)通路抑制骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究*

嚴(yán)小明1連福明1林智勤1張維2

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬三明第一醫(yī)院骨科， 福建 三明 365000;2.成都醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院， 四川 成都 610500)

【摘要】目的觀察苦參堿對(duì)成人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用及其與STAT3活化水平的聯(lián)系。方法將成人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞分為對(duì)照組(Control組)、低劑量苦參堿干預(yù)組(MAT-L干預(yù)組)及高劑量苦參堿干預(yù)組(MAT-H干預(yù)組)3組。使用MTT法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(0、24和48h)各組Saos-2細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)；使用qPCR對(duì)干預(yù)24小時(shí)后Saos-2細(xì)胞的survivin mRNA水平進(jìn)行分析，使用western blot法對(duì)干預(yù)24小時(shí)后Saos-2細(xì)胞STAT3的活化水平及survivin蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果與對(duì)照組相比，給予苦參堿干預(yù)的Saos-2細(xì)胞活性呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；給予Saos-2細(xì)胞不同濃度的苦參堿干預(yù)24小時(shí)后，survivin mRNA和蛋白的表達(dá)水平及STAT3的活化水平呈濃度依賴性降低，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論苦參堿可以通過(guò)下調(diào)STAT3的活化抑制成人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞survivin的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。該研究為苦參堿應(yīng)用于骨肉瘤及其他惡性腫瘤的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】Saos-2細(xì)胞； 苦參堿； STAT3； Survivin

骨肉瘤(osteosarcoma)是骨科最常見(jiàn)的惡性腫瘤，多見(jiàn)于青少年，高發(fā)年齡段為15～19歲。流行病學(xué)調(diào)查和臨床研究顯示，骨肉瘤全球發(fā)病率約為4/10萬(wàn)人，其惡性程度普遍較高，轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)間較早，且以肺轉(zhuǎn)移最為常見(jiàn)[1～4]。臨床和基礎(chǔ)研究證實(shí)，STAT3在肺癌、前列腺癌、胃癌和骨肉瘤等多種惡性腫瘤的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、腫瘤性血管生成以及細(xì)胞凋亡過(guò)程中扮演著重要角色，并發(fā)現(xiàn)下調(diào)STAT3的磷酸化可有效抑制骨肉瘤和肺癌等腫瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)[5～7]。苦參堿(Matrine, MAT)是植物苦參最主要的活性成分，研究表明，苦參堿具有抑制炎癥反應(yīng)、抑制腫瘤增殖分化、腫瘤血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等多種藥理作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)苦參堿抗腫瘤活性與抑制STAT3磷酸化密切相關(guān)[8，9]。本研究旨在探討苦參堿對(duì)成人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用及其與STAT3活化水平的聯(lián)系。

1材料和方法

1.1主要試劑成人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞株由上海細(xì)胞庫(kù)提供。總RNA抽提試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒和qPCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司；鼠抗人survivin抗體、鼠抗人STAT3抗體、鼠抗人phospho-STAT3抗體和鼠抗人β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；苦參堿(美國(guó)Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青)，MTT試劑盒(美國(guó)Promega公司)。其余試劑均為分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)Saos-2細(xì)胞常規(guī)接種在含10% FBS、100 g/L青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每48小時(shí)換液、傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞活性分析(MTT比色試驗(yàn))取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔接種100μl約含5×103個(gè)細(xì)胞。貼壁后無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞16～24 h，使細(xì)胞同步化。空白對(duì)照組加入PBS，低劑量苦參堿干預(yù)組(MAT-L組)加入苦參堿(終濃度為0.25 mg/ml)，高劑量苦參堿干預(yù)組(MAT-H組)加入苦參堿(終濃度為2.5 mg/ml)，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞。使用MTT比色試驗(yàn)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)(0、24和48 h)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。細(xì)胞活性(%) = (OD干預(yù)組/OD 對(duì)照組)×100%[10]。

1.4qPCR法檢測(cè)survivin mRNA表達(dá)水平按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞的總RNA并合成cDNA。然后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μl，使用β-actin作為內(nèi)參照。引物序列如下：survivin正義：5′-CATGG GTGCCCCGA CGTTG-3′，反義：5′-GCTCCG GCCAGAG GCCTCAA-3′；β-actin正義：5′-CCCAG CACAATGA AGATCAAGA TCAT -3′，反義：5′-ATCTG CTGGAAGGT GGACAGCGA-3′。使用2-ΔΔCt法對(duì)survivin mRNA表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，ΔΔCt=(Ct,目標(biāo)-Ct, β-actin)干預(yù)組-(Ct,目標(biāo)-Ct, β-actin)對(duì)照組。

1.5Western blot法檢測(cè)survivin蛋白表達(dá)水平和STAT3活化水平按照試劑盒操作要求，首先提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1小時(shí)，分別加入鼠抗人單克隆抗體survivin (1∶900)、phospho-STAT3 (1∶1000)、STAT3 (1∶1000)和β-actin (1∶1500)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

2結(jié)果

2.1MTT法測(cè)定結(jié)果與對(duì)照組比較，苦參堿干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)(0、24和48h)Saos-2細(xì)胞活性呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1　MTT比色法測(cè)定Saos-2細(xì)胞活性

注：與Control組比較，①P<0.05；與MAT-L組比較，②P<0.05

2.2survivin表達(dá)水平與對(duì)照組相比較，苦參堿干預(yù)24小時(shí)后，Saos-2細(xì)胞survivin的表達(dá)水平呈劑量依賴性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表2。

2.3STAT3活化水平與對(duì)照組相比，苦參堿干預(yù)24小時(shí)后，Saos-2細(xì)胞STAT3活化水平呈劑量依賴性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖2。

圖1Saos-2細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)的western blot結(jié)果

Figure 1The western blot result of the protein expression of survivin in Saos-2 cells

Table 2The expression of survivin and the activation of STAT3 in Saos-2 cells

組別survivinmRNAsurvivin蛋白STAT3活化水平Control組10.94±0.050.96±0.02MAT-L組0.75±0.13①0.77±0.12①0.75±0.11①M(fèi)AT-H組0.38±0.04①②0.45±0.08①②0.41±0.06①②

注：與Control組比較，①P<0.05；與MAT-L組比較，②P<0.05

3討論

骨肉瘤是源于成骨細(xì)胞(osteoblast)、成軟骨細(xì)胞(chondroblast)和成纖維細(xì)胞(fibroblast)等骨組織細(xì)胞的惡性腫瘤[1～4]。骨肉瘤多見(jiàn)于青少年， 15～19歲

圖2Saos-2細(xì)胞STAT3活化的western blot結(jié)果

Figure 2The western blot result of the activation of STAT3 in Saos-2 cells

為高發(fā)年齡段，約60%的患者<20歲，>60歲的患者僅占10%左右[1～4]。流行病學(xué)調(diào)查和臨床研究顯示，骨肉瘤發(fā)病率位居青少年惡性腫瘤發(fā)病率的第三位，全球發(fā)病率約為4/10萬(wàn)人[1～4]。同時(shí)研究顯示，骨肉瘤的惡性程度一般較高，易出現(xiàn)原位復(fù)發(fā)，且部分患者早期即出現(xiàn)血運(yùn)轉(zhuǎn)移，以肺和肝臟轉(zhuǎn)移最為常見(jiàn)[1～4]。目前骨肉瘤的治療仍以放化療為主，患者中位生存期和1年生存率等指標(biāo)仍不理想。發(fā)掘新的有效治療骨肉瘤的藥物具有較高的臨床意義。

苦參又稱地槐、野槐，是豆科槐屬植物苦參的干燥根莖部分，臨床多用于細(xì)菌性皮炎、細(xì)菌性痢疾及婦科炎癥的治療?？鄥A(Matrine, MAT)是中藥苦參最主要的有效成分，研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿具有抑制氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、抑制腫瘤增殖分化、腫瘤血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等多種藥理作用[11～14]。包桂蘭等研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)減輕局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)元的損傷[11]。Ma X等研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿能有效地減輕博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織炎癥反應(yīng)和纖維化[12]。趙軍艷等發(fā)現(xiàn)，苦參堿可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤凋亡抑制肝癌SMMC-7721的分化和增殖[13]。馬玲娣等人還發(fā)現(xiàn)，苦參堿對(duì)白血病K562細(xì)胞有顯著地抑制作用[14]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)苦參堿干預(yù)后，骨肉瘤Saos-2細(xì)胞活性呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。提示苦參堿對(duì)骨肉瘤Saos-2細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿的抗腫瘤和抗炎等生物活性與STAT3密切相關(guān)。STAT3屬于轉(zhuǎn)錄信號(hào)傳導(dǎo)子與激活子家族(signal transducers and activators of transcription, STATs)成員，廣泛參與了炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和分化、血管生成和凋亡調(diào)控等多種病理和生理過(guò)程。王秀玉等人發(fā)現(xiàn)，苦參堿可以通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路有效減輕感染性休克大鼠腎組織的炎癥反應(yīng)和組織損傷[15]。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，STAT3對(duì)肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌和骨肉瘤等多種惡性腫瘤的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、腫瘤性血管生成以及細(xì)胞凋亡過(guò)程亦有重要的調(diào)控作用[5～7,16，17]。下調(diào)STAT3的活化和表達(dá)可以有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，并認(rèn)為該過(guò)程與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[5～7,18]。孫紹娟等人證實(shí)，使用siRNA技術(shù)沉默STAT3可以有效抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖和分化。Tu B等人通過(guò)在體和離體實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，IL-6可以通過(guò)上調(diào)STAT3活化促進(jìn)骨肉瘤Saos-2細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，同時(shí)發(fā)現(xiàn)抑制STAT3后Saos-2細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力顯著降低[16]。Wang X等人的研究也發(fā)現(xiàn)，STAT3抑制劑S3I-201對(duì)包括Saos-2細(xì)胞等多個(gè)骨肉瘤細(xì)胞系有顯著地抑制作用，并可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡[17]。在本研究中我們對(duì)STAT3的活化水平及STAT3下游細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控關(guān)鍵分子survivin進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在給予苦參堿干預(yù)24小時(shí)后Saos-2細(xì)胞的STAT3活化水平及survivin mRNA和蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示苦參堿對(duì)骨肉瘤Saos-2細(xì)胞STAT3的活化有顯著抑制作用。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦參堿可以通過(guò)抑制STAT3磷酸化下調(diào)survivin的表達(dá)，從而抑制骨肉瘤Saos-2細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)為苦參堿應(yīng)用于骨肉瘤及其他惡性腫瘤的臨床治療提供了新的思路。

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Matrine suppresses the proliferation of osteosarcoma Saos-2 cells by inactivation of STAT3YAN Xiaoming, LIAN Fuming, LIN Zhiqin,etal

(1.DepartmentofOsteology,TheAffiliatedSanmingFirstHospitalofFujianMedicalUniversity,

Sanming365000,Fujian,China;

2.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610500,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the anti-proliferative value of matrine (MAT) in osteosarcoma Saos-2 cells, and its underlying mechanism. MethodsOsteosarcoma Saos-2 cells were divided into 3 groups, Control group, Low-dosage matrine (MAT-L) group and High-dosage matrine (MAT-H) group. MTT was performed to measure the cell viabilities of Saos-2 cells in different time points (0h, 24h and 48h). After 24 hours interventions, the mRNA expression of survivin was analyzed by qPCR. Meanwhile, the protein expression of survivin and the activation of STAT3 were detected by western blot.ResultsThe cell viabilities of Saos-2 cells were time-dependently and dosage-dependently inhibited by MAT administrations. Meanwhile, after 24 hours intervention, the mRNA and protein expression of survivin, and the activation of STAT3 were all dosage-dependently down-regulated by MAT in Saos-2 cells. ConclusionMatrine (MAT) could inhibit the tumor proliferation and survivin expression through inactivation of STAT3 in osteosarcoma Saos-2 cells.

【Key words】Saos-2 cells; Matrine; STAT3; Survivin

(收稿日期：2015-01-13； 編輯： 母存培)

基金項(xiàng)目：四川省教育廳課題(11ZB172)

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.09.002