骨髓間充質干細胞作為攜帶PEDF基因載體的可行性研究*

陳巧玲1別俊1白亦光2胡欣1文世民1李光明1

(川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院·南充市中心醫(yī)院； 1.腫瘤治療中心; 2. 骨科， 四川 南充 637000)

【摘要】目的探討采用重組色素上皮源性因子腺病毒(Ad-PEDF)轉染小鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)后，評估MSCs作為攜帶PEDF基因載體的可行性。方法Ad-PEDF在HEK293細胞中擴增、并純化后。將其轉染入MSCs(MSCs-PEDF)，用Western Blot和ELISA檢測培養(yǎng)上清液中PEDF的表達。通過人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)成管抑制實驗和遷移抑制實驗來評估MSCs-PEDF表達的PEDF是否具有生理活性。結果用Ad-PEDF或Ad-LacZ轉染MSCs 48小時后，用Western Blot檢測細胞培養(yǎng)上清中的PEDF為陽性表達。ELISA檢測培養(yǎng)上清中PEDF濃度為(78.8±4.8) ng/ml。 HUVECs成管抑制實驗和遷移抑制實驗顯示，MSCs-PEDF的培養(yǎng)液上清可顯著抑制HUVECs形成小管及向生長因子遷移。結論MSCs可以作為使用PEDF基因治療腫瘤的載體。

【關鍵詞】骨髓間充質干細胞； 色素上皮衍生因子； 基因治療； 抗血管生成

【中圖分類號】R 73-36

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.10.006

Abstract【】ObjectiveIn this study, we investigated the effect and mechanism of Ad-PEDF transduced MSCs and evaluated the feasibility of MSCs loaded anti-cancer gene. MethodsThe adenoviruses encoding PEDF (Ad-PEDF) were amplified in HEK293 cells and purified using the ViraTrapTM Adenovirus Purification Maxiprep Kit. MSCs were infected with Ad-PEDF and the expression of PEDF was determined by Western Blot and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The biological activity of PEDF was evaluated by HUVECs tube formation inhibition assay and migration inhibition assay. Results48 hours after Ad-PEDF or Ad-LacZ transduced, the expression of human PEDF were comfirmed by Western blot analysis and ELISA. HUVECs tube formation inhibition assay and migration inhibition assay showed that the conditioned media from MSCs-PEDF dramatically blocked the tube formation and HUVECs migration. ConclusionMesenchymal stem cells have the potential application as delivery vehicles of PEDF gene for cancer therapy.

基金項目：四川省教育廳科研項目(15ZA0216,15ZB0201)；南充市科技支撐項目(14A0017，14A0022)

通訊作者：白亦光，E-mail: baiyiguang@163.com

收稿日期：(2014-09-04； 編輯： 陳舟貴)

Study to evaluate the feasibility of mesenchymal stem cells as delivery vehicles ofPEDFgeneCHEN Qiaoling,BAI Yiguang,BIE Jun

(DepartmentofOncology,NanchongCentralHospital,TheSecondClinicalCollegeof

NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

【Key words】Mesenchymal stem cells; Pigment epithelium-derived factor; Gene therapy; Anti-angiogenesis

血管生成是腫瘤生長和轉移的必要條件[1,2]，因此，抗血管生成治療是腫瘤治療的一個重要部分。色素上皮衍生因子(PEDF)是已知最強的內源性血管生成抑制因子，可通過抑制血管內皮細胞增殖、遷移及誘導其凋亡來發(fā)揮其抗血管生成作用[3]。重組PEDF蛋白以及病毒載體介導的PEDF基因治療已應用于多個實驗研究，并顯示出治療前景[4]。但在血漿中的半衰期較短、難以有效地到達腫瘤組織降低了可能的治療效果。骨髓間充質干細胞(MSCs)作為一種新穎、有效的靶向腫瘤細胞的載體可能為提高PEDF的治療效果提供一種新的策略[5]。本研究擬通過重組色素上皮源性因子腺病毒(Ad-PEDF)轉染小鼠MSCs后，通過人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)成管抑制實驗和遷移抑制實驗來評估MSCs-PEDF表達的PEDF是否具有生理活性。從而評估MSCs作為腫瘤基因治療的載體的可行性。

1材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)

1.1.1293細胞的培養(yǎng)將293細胞置于含有10%FBS及100U/ml阿米卡星的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2， 95%濕度條件下的孵箱中培養(yǎng)，以 0.25% 的胰蛋白酶消化，一般2～3天傳代一次。

1.1.2人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的分離及培養(yǎng)取產后新鮮臍帶15～20cm，PBS溶液多次清洗后，用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端注入0.1%的膠原酶。室溫下消化15分鐘。 松開下端血管鉗，將收集的消化液體離心(1500轉/分)3min。棄去上清，用EBM-2培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)瓶中，置于孵箱中培養(yǎng)。傳至第2～6代的HUVECs用于后續(xù)實驗。

1.1.3小鼠MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定取6～8周齡C57BL/6雌性小鼠，處死后在無菌條件下取股骨和脛骨，用低糖DMEM沖洗骨髓腔3～5次，移入無菌離心管中，離心后用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，并接種于方瓶中，置于孵箱中培養(yǎng)。第5～8代MSCs用于后續(xù)實驗。選用CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105作為其鑒定標記，對MSCs進行鑒定。

1.2方法

1.2.1PEDF重組腺病毒載體(Ad-PEDF)的擴增與純化①Ad-PEDF的擴增：將293細胞傳代培養(yǎng)，當其密度達到90%時，加入適量病毒上清感染細胞。約2～3天后出現細胞病變，待細胞幾乎變圓，且有一半細胞漂浮時，收集細胞上清液至離心管中(3000轉/分)，4℃離心10min，將上清液用0.45μm濾器過濾，保存于-80℃。②Ad-PEDF的PCR鑒定：用PCR電泳鑒定擴增的病毒是否帶有PEDF基因，上游引物：CCCAAGCTTATGCAGGCCCTGGTGCTACTC；下游引物：CCGGATATCTTAGGGGCCCCTGGGGTC CAG。③病毒純化與滴度測定(TCID50法)：使用Vira TrapTMAdenovirus Purification Maxiprep Kit 純化病毒(步驟見說明書)。將293細胞以1×104個/孔接種于96孔板中，將病毒液按對數級稀釋(10-5～10-10)，每個濃度設置10個復孔，連續(xù)觀察10天后記錄每個稀釋度出現CPE(致細胞病變效應)的孔數，計算細胞病變率。如果某一濃度各孔細胞全部病變，比率為1，如無細胞病變，則比率為0。按公式計算病毒滴度：

T=101+d(s-0.5)/ml

d=Log10 of the dilution

S=Sum of ratios (start from the 10-1dilution)

將TCID50/ml轉換為PFU/ml：

T = a×10bTCID50/ml = a×10b-0.7PFU/ml

1.2.2重組腺病毒體外感染MSCs加入含有適量 Ad-PEDF 重組腺病毒低糖DMEM，感染復數(MOI)=1500，搖勻，置于孵育箱中培養(yǎng)4小時后換液，48小時后收集感染后MSCs。同時以Ad-LacZ感染的MSCs作為對照。將Ad-PEDF、Ad-LacZ病毒轉染細胞分別命名為MSCs-PEDF和MSCs-LacZ。

1.2.3檢測 MSCs-PEDF 中 PEDF蛋白的體外表達①樣品制備：分別加入Ad-PEDF、Ad-LacZ感染MSCs。未加病毒的MSCs作為對照。收集各組的培養(yǎng)液上清，采用Western blot 體外表達的PEDF蛋白進行鑒定分析，采用ELISA測定培養(yǎng)上清中PEDF濃度，分別測定三組培養(yǎng)上清中的PEDF濃度。②驗證重組PEDF的生物學活性：采用人臍靜脈血管內皮細胞 (HUVECs) 成管實驗及遷移實驗驗證重組PEDF的生物學活性。

2結果

2.1　小鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)的分離培養(yǎng)和鑒定

2.1.1MSCs的原代培養(yǎng)原代細胞生長較慢，兩周左右可長滿瓶底，傳代后細胞生長速度則明顯加快，可得到較高純度的MSCs。傳代3次后，細胞形態(tài)較為一致，呈長梭形，多為平行排列生長或漩渦狀生長，見圖1。

2.1.2MSCs表面標志物的鑒定流式細胞術檢測第3代MSCs上的表面標志物，CD44、CD73、CD90、CD105均呈陽性表達，而造血干細胞、內皮細胞表達的CD34、CD45則呈陰性表達，與以前文獻報道一致[5,6]，見圖2。

2.2重組腺病毒驗證及滴度測定DNA電泳顯示Ad-PEDF泳道在1200bp～1500bp之間出現一單一條帶，而空載腺病毒Ad-LacZ泳道則無條帶出現。說明擴增的腺病毒含有PEDF基因，見圖3。

2.3Ad-PEDF轉染MSCs后重組PEDF的體外表達檢測轉染的Ad-PEDF的MSCs(MSCs-PEDF)細胞裂解液及培養(yǎng)液上清在50KD處均出現一明顯條帶，而Ad-LacZ轉染的MSCs(MSCs-LacZ)以及未轉染病毒的MSCs細胞裂解液及培養(yǎng)液上清則未見條帶出現。說明MSCs-PEDF可表達重組PEDF并分泌至細胞外。ELISA檢測結果表明，MSCs-PEDF培養(yǎng)上清中的PEDF濃度可78.8ng/ml，而MSCs-LacZ及MSCs則僅微量表達，見圖4，5。

圖1原代(圖a)及第3代(圖b)C57BL/6小鼠MSCs(×100)

Figure 1The original generation (left) and the 3rd generation (right) MSCs of C57BL / 6 mice

圖2流式細胞術分析MSCs表面標志物

Figure 2Surface markers of MSCs analyzed by flow cytometry

圖3PCR驗證PEDF重組腺病毒

Figure 3Ad-PEDF analyzsed by PCR

圖4Western Blot分析重組PEDF的表達

Figure 4Expression of Ad-PEDF analyzed by Western Blot

注：a．細胞裂解液；b. 細胞培養(yǎng)液上清

圖5ELISA檢測細胞培養(yǎng)液上清中的PEDF濃度

Figure 5The concentration of PEDF analyzed by ELISA in cell culture supernatant

2.4　重組PEDF的體外活性檢測

2.4.1人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)成管抑制實驗MSCs-PEDF培養(yǎng)液上清可顯著抑制HUVECs形成小管，而MSCs與MSCs-LacZ培養(yǎng)液上清則對成管無影響，見圖6。

2.4.2人臍靜脈血管內皮細胞 (HUVECs) 遷移抑制實驗 HUVECs可穿過Matrigel和膜屏障向下層含有生長因子的EBM-2培養(yǎng)基遷移。MSCs-PEDF培養(yǎng)上清可顯著抑制HUVECs的遷移能力，而MSCs和MSCs-LacZ培養(yǎng)上清則不能抑制HUVECs遷移，見圖7。

3討論

研究結果表明，MSCs-PEDF分泌的重組PEDF可通過抑制內皮細胞成管和遷移而發(fā)揮其抗血管生成活性。我們通過體外實驗證明了攜帶有PEDF基因的MSCs在細胞裂解液及培養(yǎng)液中陽性表達PEDF，并且可抑制內皮細胞成管和遷移而發(fā)揮其抗血管生成活性。腫瘤進展依賴于新的血管網的生成以供給其營養(yǎng)[7]。血管生成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移過程中都發(fā)揮著重要作用。如果能有效地阻止腫瘤的血管生成，就有望控制手術或放、化療治療后腫瘤的復發(fā)和轉移。

PEDF最初是從胎兒視網膜色素上皮細胞中分離得到，而近年來，人們發(fā)現它有著強有力的抗血管生成活性，比起其他內源性血管抑制因子如：angiostatin、thrombospondin-1和endostatin 等作用更強[8]。PEDF可通過以下機制來實現其對血管生成的抑制作用：①抑制內皮細胞增殖和遷移以及形成小管。②通過Fas/FasL通路誘導內皮細胞凋亡。③下調促血管

圖6MSCs-PEDF表達的重組PEDF體外抑制HUVECs形成小管

Figure 6PEDF expressed from MSCs-PEDF inhibit HUVECs form small tube in vitro

圖7 MSCs-PEDF表達的重組PEDF體外抑制HUVECs遷移

Figure 7PEDF expressed from MSCs-PEDF inhibit HUVECs migration

生成因子特別是VEGF的表達，從而打破促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡[9]。以上的生理特性，奠定了PEDF應用于腫瘤治療的基礎。目前，已有大量的實驗研究顯示，PEDF可顯著抑制腫瘤的生長和轉移[10]。純化的重組蛋白在體內易于降解，純化困難，價格較昂貴。而以病毒或非病毒為載體的基因治療難以在腫瘤組織內達到較高的治療濃度。這些缺點大大降低了它們潛在的治療效果和應用價值。因此，如何將PEDF基因有效地運送到腫瘤部位，并使其在局部持續(xù)表達是本實驗今后的研究重點。

4結論與啟示

骨髓間充質干細胞(MSCs)作為一種理想的細胞載體而被廣泛應用于腫瘤的基因治療。MSCs作為細胞載體的優(yōu)勢在于MSCs的低免疫原性可使其在宿主體內存活數百天以上并長效表達外源基因，以及MSCs具有向腫瘤組織歸巢的特性。因此，MSCs是一個相對完美的運輸載體，可以保護PEDF基因在循環(huán)系統(tǒng)中不被清除，并且也不會因為在血液中濃度過高而對其他組織造成影響，同時還可促進PEDF的治療作用。MSCs-PEDF可定向遷移到腫瘤部位，而Ad-PEDF卻沒有這種能力。本實驗結果提示重組PEDF腺病毒轉染的MSCs能表達、分泌PEDF蛋白，可成為PEDF基因治療腫瘤的載體。

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