酶催化光度法測(cè)定藥物中的對(duì)乙酰氨基酚

黃秋麗 ， 楊倩倩 ， 陳亞紅

(周口師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院 ， 河南 周口466000)

摘要：基于對(duì)乙酰氨基酚對(duì)牛血紅蛋白模擬酶催化體系的抑制作用，建立了一種簡(jiǎn)單、靈敏的酶催化光度法測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚的新方法。研究了該抑制反應(yīng)的最佳實(shí)驗(yàn)條件及動(dòng)力學(xué)行為，測(cè)定的線性范圍為4.72×10-7～9.45×10-5mol/L，檢出限為1.13×10-8mol/L。對(duì)濃度為4.72×10-6mol/L的對(duì)乙酰氨基酚進(jìn)行11次平行測(cè)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1﹪。該方法可用于對(duì)乙酰氨基酚片中對(duì)乙酰氨基酚含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：卡托普利 ； 酶催化光度法 ； 血紅蛋白

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.32文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

收稿日期：2014-12-29

基金項(xiàng)目：河南省教育廳基礎(chǔ)前沿技術(shù)項(xiàng)目(No14A150015)，周口師范學(xué)院大學(xué)生科研創(chuàng)新

作者簡(jiǎn)介：黃秋麗(1993-)，女，本科在讀；聯(lián)系人：陳亞紅(1975-)，女，博士，教授，從事分析化學(xué)的教學(xué)及分子光譜分析的研究工作；

目前文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚的方法主要有分光光度法[1-2]、高效液相色譜法[3]、 電化學(xué)分析法[4-5]、熒光光譜法[6]和化學(xué)發(fā)光法[7]等。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析法在臨床、藥物、農(nóng)業(yè)、工業(yè)過(guò)程檢測(cè)中都具有廣泛應(yīng)用，采用酶法分析對(duì)乙酰氨基酚還未見(jiàn)報(bào)道。

血紅蛋白( Hb) 具有和天然生物酶辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 相同的鐵卟啉輔基和相似的空間結(jié)構(gòu)，并且具有穩(wěn)定、價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)[9]。在堿性介質(zhì)中，血紅蛋白對(duì)過(guò)氧化氫氧化酸性鉻藍(lán)K具有強(qiáng)烈的催化作用，而對(duì)乙酰氨基酚對(duì)該體系具有強(qiáng)烈的抑制作用。據(jù)此建立了測(cè)定藥劑中對(duì)乙酰氨基酚含量的酶催化動(dòng)力學(xué)分析新方法。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

JASCO-UV530型紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本分光公司)；pHS-3C型酸度計(jì)(上海理達(dá)儀器廠)；電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)。牛血紅蛋白(生化試劑；上海伯奧生物科學(xué)有限公司)；酸性鉻藍(lán)K(北京化學(xué)試劑廠)；H2O2溶液；NH4Cl-NH3·H2O緩沖溶液。

對(duì)乙酰氨基酚(上海瑞齊生物科技有限公司)標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.142 8 g的對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品，加熱水溶解后用蒸餾水稀釋成100 mL，得到濃度為9.45×10-3mol/L的儲(chǔ)備液(4 ℃冰箱保存)；工作液：用水稀釋成9.45×10-4mol/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。所用試劑均為分析純，水均為二次蒸餾水。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL比色管中依次加入pH值為10.7的NH4Cl-NH3·H2O緩沖溶液2.0 mL，濃度為1.0×10-4mol/L的酸性鉻藍(lán)K溶液4.8 mL，1.0×10-3mol/L的H2O2溶液1.1 mL，不同濃度的對(duì)乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為5.0×10-6mol/L的牛血紅蛋白溶液2.0 mL，用二次蒸餾水定容。在室溫下放置20 min后，用1 cm吸收皿，以蒸餾水作參比，在539 nm處測(cè)量吸光度。以不加牛血紅蛋白和對(duì)乙酰氨基酚的試劑溶液為空白A0，不加對(duì)乙酰氨基酚的試劑溶液吸光度A1，加對(duì)乙酰氨基酚的試劑溶液吸光度A2，其計(jì)算抑制率[I(%)=100(A2-A1)/(A0-A1)]用所得抑制率對(duì)對(duì)乙酰氨基酚的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2結(jié)果與討論

2.1　吸收光譜

在血紅蛋白的催化作用下，H2O2能夠氧化酸性鉻蘭K并使之褪色。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)乙酰氨基酚對(duì)此催化體系有強(qiáng)烈的抑制作用，藉此建立了一種催化光度法測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚的新方法。如圖1所示，最大吸收波長(zhǎng)均為539 nm，加入血紅蛋白后體系的吸光度明顯降低(如圖1中的2)，而加入對(duì)乙酰氨基酚后體系吸光度降低較少(如圖1中的3)，表明對(duì)乙酰氨基酚對(duì)血紅蛋白催化H2O2氧化酸性鉻藍(lán)K的體系有強(qiáng)烈的抑制作用。

E-mail：chen-yh75@163.com

1.空白：pH值10.7的NH 3-NH 4Cl+4.8×10 -5mol/L酸性鉻藍(lán)水+1.1×10 -4mol/L H 2O；2.空白+1.1×10 -6mol/L血紅蛋白；3.空白+9.45×10 -5mol/L對(duì)乙酰氨基酚+1.0×10 -6mol/L血紅蛋白。 圖1　體系的吸收光譜

2.2　測(cè)定條件的優(yōu)化

2.2.1酸度條件的選擇

通過(guò)實(shí)驗(yàn)分別考察了pH值為9.5、9.8、10.1、10.4、10.7、11.0的NH4Cl-NH3·H2O緩沖溶液對(duì)體系的影響，見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同pH值的NH4Cl-NH3·H2O緩沖溶液對(duì)該體系有不同程度的影響。結(jié)果表明：在pH值10.7的NH4Cl-NH3·H2O緩沖溶液介質(zhì)中，對(duì)乙酰氨基酚對(duì)體系的抑制作用最強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇pH值為10.7的NH4Cl-NH3·H2O緩沖溶液。

圖2　酸度的影響

2.2.2酸性鉻蘭K濃度的影響

分別試驗(yàn)了不同濃度的酸性鉻蘭K對(duì)該體系的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著酸性鉻蘭K濃度的增大，對(duì)乙酰氨基酚對(duì)體系的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)酸性鉻蘭K溶液的濃度超過(guò)4.8×10-5mol/L時(shí)抑制作用達(dá)最大值且趨于穩(wěn)定。因此，實(shí)驗(yàn)選擇酸性鉻蘭K溶液的最佳濃度為4.8×10-5mol/L。

圖3　酸性鉻藍(lán)K濃度的影響

2.2.3H2O2濃度的影響

H2O2在反應(yīng)體系中作為氫受體底物，它的濃度直接影響到反應(yīng)的速度和完全程度(見(jiàn)圖4)。濃度過(guò)高，對(duì)乙酰氨基酚易被氧化；濃度過(guò)低，氧化反應(yīng)不完全。選擇H2O2的濃度為1.1×10-4mol/L。

圖4　H 2O 2濃度的影響

2.2.4血紅蛋白濃度的影響

分別試驗(yàn)了不同濃度的血紅蛋白對(duì)體系的影響。結(jié)果表明：隨著血紅蛋白濃度的增大，對(duì)乙酰氨基酚對(duì)體系的抑制作用先增大再逐漸減小，當(dāng)血紅蛋白的濃度為1.0×10-6mol/L時(shí)，對(duì)乙酰氨基酚對(duì)體系的抑制作用最強(qiáng)(如圖5所示)。所以，試驗(yàn)選擇血紅蛋白的濃度為1.0×10-6mol/L。

圖5　血紅蛋白濃度的影響

2.2.5反應(yīng)時(shí)間的確定

研究了不同對(duì)乙酰氨基酚濃度下反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)行為。隨著對(duì)乙酰氨基酚濃度的增大，其對(duì)體系的抑制作用也逐漸增強(qiáng)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)速度逐漸減慢，室溫20 min 后體系趨于穩(wěn)定，因此，選擇20 min作為體系的反應(yīng)時(shí)間。

2.3　分析方法特性

在上述最佳實(shí)驗(yàn)條件下按實(shí)驗(yàn)方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)乙酰氨基酚的濃度在4.72×10-7～9.45×10-5mol/L范圍內(nèi)與抑制率有良好的線性關(guān)系。其線性回歸方程為：

I(%)=(16.909 8±2.582 4)+(5.193 8±

其中，r為線性相關(guān)系數(shù)，n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)。方法檢出限，經(jīng)3Sb/k(Sb為11次空白信號(hào)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為線性方程的校正斜率)計(jì)算，得該方法的檢出限為1.13×10-8mol/L。對(duì)濃度為4.72×10-6mol/L的對(duì)乙酰氨基酚進(jìn)行11次平行測(cè)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%，表明該方法具有較好的重現(xiàn)性和精密度。將本法與其他測(cè)定方法進(jìn)行比較(見(jiàn)表1)，可知本法具有較高的靈敏度。

表1　乙酰氨基酚不同測(cè)定方法反應(yīng)特性比較

2.4　共存物質(zhì)影響

2.5　樣品分析

取藥品10片(河北冀衡藥業(yè)有限公司)，稱(chēng)重后研細(xì)，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1690 g細(xì)粉(約相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚0.142 8 g)，用熱水溶解，再用蒸餾水定容成100 mL，搖勻。用干燥的定量濾紙過(guò)濾。取濾液適量，用蒸餾水稀釋10倍后，按實(shí)驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2，從表2中看出，回收率為：99.6%～102.3%。結(jié)果滿意。

表2　樣品分析結(jié)果( n=5)

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