薛春霞等

摘要：使用電化學(xué)聚合法在碳糊電極（CPE）的表面制備了血紅蛋白分子印跡聚合物膜，并對(duì)其制備條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，電聚合過程中掃描速度為0.05 V/s、聚合圈數(shù)為5、單體濃度為0.5 mol/L、交聯(lián)劑濃度為0.10 g/mL時(shí)制備的修飾電極在循環(huán)伏安法鐵化氰鉀中的還原峰電流最弱，說明修飾電極的負(fù)載量達(dá)到最大。

關(guān)鍵詞：分子印跡聚合物；血紅蛋白；電化學(xué)傳感器

中圖分類號(hào)：O657.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）16-4019-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.048

The Preparation of Biological Macromolecules Imprinted Polymer

XUE Chun-xia1， LI Jing2， ZHANG Xiao-ran3

（1.Chutian College of Huazhong Agricultural University ， Wuhan 430205， China；

2. Xi'an University of Arts and Science， Xi′an 710065， China； 3. Xi'an University of Architecture and Technology， Xi′an 710055， China）

Abstract： Hemoglobin molecularly imprinted polymer membranes on the surface of carbon paste electrode （BHb/MIP-CPE） was prepared by electrochemical polymerization， and the preparation conditions were optimized. The results showed that the electrochemical polymerization of scan rates of 0.05 V/s， cycles for 5 times， the concentration of monomer（AM） for 0.5 mol/L and the concentration of cross linking agent（MBA） for 0.01 g/mL were optimization for reduction peak current of the modified electrode in 5.0 mM K3Fe（CN）6 of cyclic voltammograms， which indicated the modified electrode capacity reached the highest.

Key words： imprinted polymer； hemoglobin； electrochemical sensors

分子印跡聚合物對(duì)模板分子的立體結(jié)構(gòu)具有“記憶”功能，從而對(duì)模板表現(xiàn)出高度選擇性識(shí)別能力。依據(jù)功能單體和模板分子的作用機(jī)理不同，分子印跡可分為共價(jià)印跡和非共價(jià)印跡兩大類。前者是模板分子與功能單體先通過共價(jià)鍵結(jié)合繼而進(jìn)一步聚合進(jìn)行印跡的方法；而后一種方法是基于模板分子與功能單體之間通過氫鍵、離子鍵、π堆積、范德華力等形成預(yù)組織化合物，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步聚合得到印跡聚合物。鑒于分子印跡聚合物對(duì)模板的選擇性識(shí)別能力，其作為分離富集材料和傳感器的敏感元件以及催化劑等在諸多分析領(lǐng)域的應(yīng)用前景一直備受關(guān)注[1]。然而迄今為止，有關(guān)分子印跡技術(shù)的研究大多停留在小分子的印跡上，人們?cè)诎被醄2，3]、金屬離子[4]、小分子藥物[5]等為模板的分子印跡研究中已經(jīng)取得長(zhǎng)足進(jìn)步。而對(duì)于生物大分子，如蛋白質(zhì)的分子印跡研究還鮮有成功的范例[6-8]。應(yīng)用到電極表面的生物大分子印跡聚合物的研究也極少報(bào)道。電化學(xué)分析方法具有很高的靈敏度，簡(jiǎn)單方便，在傳感器研究中被廣泛應(yīng)用為換能器。將具有特異選擇性的分子印跡聚合物與電化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合，可以制備出具有高選擇性和靈敏度的分子印跡電化學(xué)傳感器。本試驗(yàn)將嘗試在電極表面使用電化學(xué)方法引發(fā)丙烯酰胺制備血紅蛋白分子印跡聚合物，并對(duì)印跡膜的性質(zhì)、選擇性及檢測(cè)能力進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電化學(xué)工作站CHI660B（上海辰華儀器公司）；掃描電子顯微鏡Quanta600FEG（寧波新芝生物科技股份有限公司）；超聲波清洗機(jī)SB4200DTD（寧波新芝生物科技股份有限公司）；紅外干燥箱CJ-1（上虞市道墟星峰儀器廠）；電子天平ESJ60-4（沈陽龍騰電子稱量?jī)x器有限公司）。

牛血紅蛋白（BHb）（Sigama化學(xué)試劑公司）：溶液用磷酸鹽緩沖溶液配制（0.01 mol/L，pH 7.0）；丙烯酰胺（AM）[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）（阿拉丁工業(yè)有限公司）；pH 7.0的KH2PO4-K2HPO4緩沖溶液；所用其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法等電化學(xué)方法在CHI660B電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）上和三電極單室電解池中進(jìn)行。

碳糊電極（CPE）的制備：稱取3.4 g光譜純石墨粉和0.6 g液體石蠟置于小燒杯中，攪拌30 min，使其混合均勻呈糊狀，取適量碳糊填入經(jīng)乙醚和丙酮處理干凈的PVC塑料管中，將銅絲固定到碳糊中，再將電極表面打磨光滑。完成后將電極在PBS緩沖溶液（0.10 mol/L pH 7.0）活化掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 BHb分子印跡聚合物膜修飾電極的初步制備

試驗(yàn)以碳糊電極為工作電極，鉑電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極。電聚合底液是10 mL KH2PO4-K2HPO4的緩沖溶液，在底液中依次加入50 mg BHb（模板分子），0.75 g AM（功能單體），0.1 g MBA（交聯(lián)劑），0.25 g NaNO3和0.13 g K2S2O8（引發(fā)劑），超聲波混合、溶解均勻。試驗(yàn)前，上述溶液通氮?dú)獬?0 min，然后放入經(jīng)過預(yù)處理的碳糊電極，在（-0.2）～（-1.4）V（vs.SCE）用循環(huán)伏安法循環(huán)掃描5圈，掃描速度為0.02 V/s。電聚合完成后在KH2PO4-K2HPO4的緩沖溶液中用循環(huán)伏安法檢測(cè)BHb的氧化還原峰（圖1）[9]。在（-0.2）～（-0.4）V出現(xiàn)BHb的還原峰，初步說明BHb已固定在電極表面上。為了進(jìn)一步說明出現(xiàn)的峰是BHb的還原峰，特做了對(duì)比試驗(yàn)。將5 mg/mL BHb溶液用微量進(jìn)樣器滴涂到裸電極表面。等電極表面晾干后用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)（圖2）。由圖2可知，在（-0.2）～（-0.4）V也同樣出現(xiàn)與電化學(xué)聚合牛血紅蛋白（BHb）一樣的還原峰。

2.2 聚合物膜制備條件的優(yōu)化

電化學(xué)聚合形成蛋白質(zhì)分子印跡聚合物膜導(dǎo)電性很差，在本試驗(yàn)中使用鐵氰化鉀分子[K3[Fe（CN）6]作為探針，來間接考察印跡膜的檢測(cè)特性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子印跡膜很好的覆蓋在電極表面時(shí)，鐵氰化鉀[K3[Fe（CN）6]的電化學(xué)信號(hào)就會(huì)很弱。反之，電化學(xué)信號(hào)會(huì)增強(qiáng)。所以優(yōu)化電聚合條件時(shí)，比較峰電流高低可判斷此條件下是否有利于電聚合。

2.2.1 電聚合時(shí)掃描速度的優(yōu)化 電聚合過程中其他條件不變，只改變掃描速度（0.01、0.02、0.05、0.1 V/s）電聚合到同批的不同碳糊電極上。待電極表面晾干后取出，采用循環(huán)伏安法在鐵氰化鉀溶液中進(jìn)行檢測(cè)（圖3）。由圖3可知，掃描速度過慢時(shí)，使聚丙烯酰胺膜粗糙，易脫落，電極表面不能被膜完全覆蓋，導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)增強(qiáng)，峰電流變大。掃描速度過快，使電極表面印記膜太致密，并且蛋白質(zhì)模板深嵌在聚合物中難以洗脫。0.02 V/s到0.01 V/s這段峰電流呈下降趨勢(shì)，但因?yàn)閽咚偬焓鼓ひ酌撀洌圆辉傺芯勘?.01 V/s還小的掃描速度。圖3中顯示掃描速度0.05 V/s時(shí)峰電流最小，掃描速度又不是很快，所以在此掃描速度下有利于電聚合。

2.2.2 電聚合時(shí)掃描圈數(shù)的優(yōu)化 電聚合過程中其他條件不變，只改變掃描圈數(shù)電聚合到同批的不同碳糊電極上。本試驗(yàn)選擇了3、5、10、20、30圈5個(gè)掃描圈數(shù)。待電極表面晾干后取出，采用循環(huán)伏安法在鐵氰化鉀溶液中進(jìn)行檢測(cè)（圖4）。由圖4可知，掃描圈數(shù)過少時(shí)，使聚丙烯酰胺膜粗糙，易脫落，電極表面不能被膜完全覆蓋，導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)增強(qiáng)，峰電流變大。掃描圈數(shù)過多，使電極表面印記膜太致密，并且蛋白質(zhì)模板深嵌在聚合物中難以洗脫。雖然掃描圈數(shù)為30圈時(shí)峰電流還是呈下降趨勢(shì)，但因?yàn)槠淙?shù)太多，導(dǎo)致模板難洗脫，所以不再研究30圈以上的圈數(shù)。圖4中顯示在5圈時(shí)峰電流最低下，所以在此圈數(shù)下有利于電聚合。

2.2.3 電聚合時(shí)單體丙烯酰胺濃度的優(yōu)化 電聚合過程中其他條件不變，只改變單體濃度電聚合到同批的不同碳糊電極上。單體初始濃度常選用0.5 mol/L，本試驗(yàn)選擇了0.24、0.50、1.05、1.20、1.43 mol/L 5個(gè)單體濃度進(jìn)行優(yōu)化。待電極表面晾干后取出，采用循環(huán)伏安法在鐵氰化鉀溶液中進(jìn)行檢測(cè)（圖5）。由圖5可知，電聚合時(shí)單體濃度過低，導(dǎo)致聚丙烯酰胺斷鏈或鏈過短而無法包裹住模板分子使電極表面無法完全被電聚合膜覆蓋。單體濃度在0.5 mol/L時(shí)電化學(xué)信號(hào)最弱，所以在此濃度下有利于電聚合。

2.2.4 電聚合時(shí)交聯(lián)劑濃度的優(yōu)化 電聚合過程中其他條件不變，只改變交聯(lián)劑濃度電聚合到同批的不同碳糊電極上。試驗(yàn)選擇了0.05、0.10、0.20、0.30 g/mL 4個(gè)不同濃度，待電極表面晾干后取出，采用循環(huán)伏安法在鐵氰化鉀溶液中進(jìn)行檢測(cè)。交聯(lián)劑的作用是使模板分子和功能單體形成高度交聯(lián)、剛性的高分子聚合物，保持其三維空穴，不致于在洗脫、吸附模板分子的過程中空穴結(jié)構(gòu)坍塌或變形，能保持原空穴的空間結(jié)構(gòu)和識(shí)別位點(diǎn)的穩(wěn)定。交聯(lián)劑濃度不能過高，濃度過高會(huì)使空穴失去柔性，不利于洗脫（圖6）。由圖6可知，峰電流隨著交聯(lián)劑質(zhì)量增大而降低，但在聚合過程中交聯(lián)劑超過0.10 g/mL時(shí)，聚合液極易固化使電聚合不能正常進(jìn)行。所以0.10 g/mL交聯(lián)劑更有利于電聚合。

綜上所述，按照以上優(yōu)化條件制備出來的印記膜均勻、致密、印跡效果好。試驗(yàn)應(yīng)以鉑電極為對(duì)電極，以飽和甘汞電極作為參比電極，以碳糊電極作為工作電極。電聚合底液是10 mL KH2PO4-K2HPO4的緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.0），在底液中依次加入50 mg BHb（模板分子），0.5 mol/L AM（功能單體），0.10 g/mL MBA（交聯(lián)劑），0.25 g NaNO3和0.13 g K2S2O8（引發(fā)劑），超聲波混合、溶解均勻。試驗(yàn)前上述溶液通氮?dú)獬?0 min，然后放入經(jīng)過預(yù)處理的碳糊電極，在（-0.2）～（-1.4）V（vs.SCE）用循環(huán)伏安法循環(huán)掃描5圈，掃描速度為0.05 V/s。試驗(yàn)完畢后，將電極用去離子水沖洗干凈，先放入AcOH和SDS的混合液（AcOH 10%，SDS 10%）中洗脫2 h，然后放入0.5 mol/L H2SO4中洗脫l h，洗去模板分子，最后放入磷酸緩沖溶液中平衡30 min。對(duì)照電極的制備與上述過程相同，只是聚合液體中不加模板分子。

3 小結(jié)

在分子印跡技術(shù)中，選擇合適的功能單體與模板分子鍵合是印跡過程非常重要的環(huán)節(jié)。丙烯酰胺及其衍生物類單體己被廣泛研究和應(yīng)用于水環(huán)境下分子印跡聚合物的合成，特別是蛋白質(zhì)分子的印跡[10]。試驗(yàn)中，丙烯酰胺作為功能單體與蛋白質(zhì)分子通過非共價(jià)鍵結(jié)合，圍繞在蛋白質(zhì)分子周圍，形成特定的空間構(gòu)型，聚合反應(yīng)發(fā)生后，這種構(gòu)型就會(huì)被保存下來。試驗(yàn)得出，電聚合過程中掃描速度為0.05 V/s、聚合圈數(shù)為5、單體濃度為0.5 mol/L、交聯(lián)劑濃度為0.10 g/mL時(shí)制備的修飾電極在循環(huán)伏安法鐵氰化鉀中的還原峰電流最弱，說明修飾電極的負(fù)載量達(dá)到最大。在常規(guī)的化學(xué)方法制備聚丙烯酰胺中，一般使用氧化還原引發(fā)體系進(jìn)行引收。本試驗(yàn)中，丙烯酰胺的聚合也是氧化還原引發(fā)過程，氧化劑是K2S2O8，還原劑是施加負(fù)電位的“電極”。當(dāng)電極施加足夠負(fù)的低電位時(shí)，K2S2O8首先被還原為陰離子自由基，該自由基再進(jìn)而引發(fā)丙烯酰胺的聚合。上述反應(yīng)方程式反應(yīng)歷程可以表示為：

S2O82-+e-→SO42-+SO4-

在交聯(lián)劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）的作用下，聚丙烯酰胺在電極表面形成高交聯(lián)度，結(jié)構(gòu)致密的聚合物；如果聚合液體中含有蛋白質(zhì)模板分子，模板分子會(huì)隨著聚合物的形成一同印跡鑲嵌在聚合物骨架中。

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