王 馳 何 慧 張久亮 侯 燾 石 文 劉維維
恩施魚(yú)塘壩玉米硒富集及玉米肽抗氧化活性研究
王 馳 何 慧 張久亮 侯 燾 石 文 劉維維
(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070)
為了探究恩施魚(yú)塘壩地區(qū)硒資源的分布特點(diǎn),土壤因素對(duì)玉米中硒含量的影響以及硒含量和玉米肽(CPs)抗氧化活性的關(guān)系,本文采用玉米良種(湘玉十號(hào)),在魚(yú)塘壩附近選取16個(gè)不同地點(diǎn)種植,并分兩季采收,利用原子熒光法對(duì)玉米中蛋白質(zhì)、多糖中硒含量進(jìn)行分析,同時(shí)對(duì)種植地土壤樣本的硒含量和pH值進(jìn)行了測(cè)定。通過(guò)HepG2人體肝癌細(xì)胞模型對(duì)高硒CPs以及低硒CPs的抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明:所有玉米種植地土壤均達(dá)到富硒土壤標(biāo)準(zhǔn)(0.4 mg/kg),但其生長(zhǎng)的玉米中硒含量存在較大差異,玉米對(duì)硒的富集受到土壤硒含量、種植時(shí)間以及pH值的共同影響;玉米中蛋白和多糖具有很高的硒含量。高硒玉米和低硒玉米制成的玉米肽均表現(xiàn)出較好的抗氧化能力,但前者顯著高于后者(P<0.05),在HepG2細(xì)胞抗氧化模型中,500μg/mL濃度為玉米肽最佳抗氧化濃度;與較低硒玉米肽處理組相比,經(jīng)高硒玉米肽預(yù)處理的細(xì)胞存活率增加了24.16%。綜上所述,pH低于5的土壤對(duì)玉米吸收硒的能力有嚴(yán)重抑制作用,弱堿性土壤更適合玉米對(duì)于硒的利用,且種植時(shí)間較長(zhǎng)的老玉米硒含量更高;富硒玉米肽的抗氧化能力顯著高于低硒玉米肽。
魚(yú)塘壩 富硒玉米 玉米肽 抗氧化活性 土壤
硒作為人體必需的微量元素之一,是人體內(nèi)多種硒蛋白的必需成分,具有抗癌[1]、提高自身機(jī)體免疫力[2]、預(yù)防心腦血管疾病[3]、抗氧化[4-5]等多種生理功能。
土壤是植物硒的主要來(lái)源。世界衛(wèi)生組織公布的資料表明,全世界有40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)不同程度的缺硒,我國(guó)大約2/3的地區(qū)屬于缺硒或低硒地區(qū),其中30%左右的地區(qū)嚴(yán)重缺硒。湖北恩施享有世界硒都的美譽(yù),魚(yú)塘壩是恩施標(biāo)志性的高硒地區(qū)之一[6]。有報(bào)道指出,玉米中硒含量與土壤硒含量之間表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)關(guān)系[7],本實(shí)驗(yàn)室此前對(duì)富硒玉米肽(CPs)結(jié)構(gòu)、活性等展開(kāi)過(guò)一系列研究[8-10],其原料也主要產(chǎn)自該地區(qū),但不同批次玉米間硒含量仍然存在一定差異,故玉米中硒含量與土壤之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。另一方面,有研究表明玉米肽具有良好的清除羥基自由基的能力、清除DPPH自由基的能力和還原能力[11-13],而硒本身作為一種具有抗氧化活性的物質(zhì)在玉米肽中發(fā)揮的作用還有待研究。本研究采用玉米良種,在魚(yú)塘壩附近選取不同地點(diǎn)種植并分兩季采收,通過(guò)對(duì)玉米籽粒以及土壤中硒含量的分析,探究魚(yú)塘壩地區(qū)硒資源的分布特點(diǎn),土壤和季節(jié)因素對(duì)玉米中硒含量的影響,并通過(guò)細(xì)胞模型對(duì)高硒CPs以及低硒CPs的抗氧化活性進(jìn)行比較,為富硒CPs的深入開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。
玉米品種選取湘玉十號(hào),于湖北恩施魚(yú)塘壩附近地區(qū)定點(diǎn)種植,統(tǒng)一采收。
HepG2人肝癌細(xì)胞系:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院;堿性蛋白酶(Alcalase 3.0T):丹麥諾維信公司;培養(yǎng)基DMEM:美國(guó)Hyclone公司;胎牛血清:杭州四季青生物工程有限公司;胰蛋白酶:美國(guó)Amresco公司。
Multiskan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀:美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;超濾膜系統(tǒng)(截留相對(duì)分子質(zhì)量為5 000):美國(guó)Millipore公司;細(xì)胞培養(yǎng)板/瓶:美國(guó)Cellstar Greiner Bio公司;AFS-8220型原子熒光光度計(jì):北京吉天儀器有限公司。
1.2.1 玉米和土壤樣本獲取
在湖北恩施魚(yú)塘壩地區(qū)9平方公里范圍內(nèi)選取16處玉米種植地如表1所示(每處種植地之間至少間隔500 m),采用湘玉十號(hào)玉米品種于5月中旬播種,當(dāng)年8月和10月分2次采收(嫩玉米、老玉米)。采收后的新鮮玉米曬干至恒重后剝下玉米粒,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
表1 玉米樣品產(chǎn)地和批次
各玉米種植區(qū)域采用多點(diǎn)取樣法,隨機(jī)均勻采集土壤樣本,除去枯枝敗葉、石礫等雜質(zhì),充分混勻,自然干燥至恒重后研磨、過(guò)篩,放入統(tǒng)一密封袋中,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 玉米蛋白的提取
采用本實(shí)驗(yàn)室建立的堿醇提取、等電點(diǎn)沉淀的方法[10]制備玉米蛋白。
1.2.3 玉米多糖的提取
玉米籽?!磧簟娓伞鬯椤^(guò)40目篩→取一定量玉米粉→按照料液比1∶20(m/V)加入蒸餾水→60℃下超聲提取50 min→4 000 r/min離心10 min→取上清液,將沉淀再重復(fù)提取1次→合并上清液→旋蒸濃縮→將濃縮液與Sevag試劑(氯仿、正丁醇按4∶1混合)按4∶1混合→震蕩混勻后裝入分液漏斗靜置→待溶液分層后取上層溶液,重復(fù)加入Sevag試劑混勻靜置,直至分層后液面交界處無(wú)白色混懸→加入3倍體積95%乙醇沉淀多糖→4 000 r/min離心10 min,取沉淀→冷凍干燥48 h。
1.2.4 CPs的制備
采用本實(shí)驗(yàn)室建立的最佳堿性蛋白酶水解和超濾方法進(jìn)行制備:富硒玉米蛋白粉→按料液比1∶35(m/V)加水→沸水浴處理30 min→調(diào)溫、調(diào)pH至一定溫度和蛋白酶的最適pH 8.00→按酶底比0.6%(E/S,m/m)加入Alcalase堿性蛋白酶→邊攪拌邊不斷加入0.1 mol/L NaOH溶液,以維持pH 8.00不再變化→取出燒杯冷卻至室溫→選用截留相對(duì)分子質(zhì)量為5 000的再生纖維素卷式超濾膜進(jìn)行超濾分離,膜透過(guò)物冷凍干燥48 h,在此工藝條件下,肽回收率為73.32%[10]。
1.2.5 硒含量的測(cè)定
樣品前處理:
玉米籽粒→洗凈→烘干→粉碎→過(guò)40目篩;凍干后的蛋白、多糖樣品→磨碎→過(guò)40目篩;土壤樣品→冷凍干燥48 h→磨碎→過(guò)40目篩。
硒含量測(cè)定參照GB/T 21729—2008,氫化物發(fā)生-熒光光譜法(HG-AFS)定量測(cè)硒。
1.2.6 土壤樣本pH值測(cè)定
土壤pH的測(cè)定參照NY/T 1121第2部分所述方法:將干燥的土壤樣品研磨過(guò)篩后,精確稱(chēng)取10 g(精確到0.01 g)于燒杯中,加入超純水25 mL,用攪拌器攪拌1 min,使其充分混勻,放置30 min后測(cè)定。
將pH計(jì)電機(jī)插入試樣懸浮液中,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)燒杯以除去電極的水膜,促使其快速平衡,靜置片刻后按下讀數(shù)按鈕,待讀數(shù)穩(wěn)定后記下pH值。
1.2.7 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)
人肝癌HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞存放在37℃和含5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育,呈現(xiàn)出單層貼壁生長(zhǎng)。試驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化,加入適量含血清的培養(yǎng)基終止消化,取適量細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶。
1.2.8 細(xì)胞氧化損傷模型的建立
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞,并調(diào)整至約為8×104個(gè)/mL,接種于96孔板內(nèi),每孔100 μL。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,待細(xì)胞貼壁后,吸棄上清液。試驗(yàn)組分別加入不同濃度的H2O2(100~800 μmol/L)100 μL,培養(yǎng)板于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,其中空白調(diào)零組只添加培養(yǎng)液,對(duì)照組為含細(xì)胞不加藥組,每組設(shè)5復(fù)孔,培養(yǎng)結(jié)束后,吸棄上清液,每孔加無(wú)血清培養(yǎng)液200μL濃度為5 mg/mL的MTT 20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,盡可能的吸去上清液,每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO),室溫下在搖床上震蕩10 min,充分混勻并溶解藍(lán)紫色的甲臜顆粒。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇490 nm波長(zhǎng),測(cè)定各孔吸光度值A(chǔ)490。試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值,按公式計(jì)算:
細(xì)胞存活率=(試驗(yàn)組A490-空白組A490)/(對(duì)照組A490-空白組A490)×100%
1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,所有的數(shù)據(jù)均以X±SD表示,通過(guò)組間LSD檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。
由表2可知,生長(zhǎng)于不同地理?xiàng)l件下的玉米硒含量存在較大差異。其中編號(hào)為7、8的玉米樣品均未檢出硒。編號(hào)為6、8的嫩玉米樣品硒含量在檢測(cè)限以下,但老玉米樣品檢出微量硒。嫩玉米中硒含量最高的4號(hào)樣品,硒含量為1.061 mg/kg;老玉米中硒含量最高的15號(hào)樣品,硒含量為3.944 mg/kg。
表2 不同產(chǎn)地玉米樣本、土壤硒含量以及土壤pH
同時(shí),生長(zhǎng)于同一地區(qū)的嫩玉米與老玉米因收獲時(shí)間不同硒含量存在一定差異,除11號(hào)玉米樣品外,其他批次老玉米樣品其硒含量均高于嫩玉米,說(shuō)明延長(zhǎng)種植時(shí)間可促進(jìn)玉米對(duì)硒的吸收。但這種促進(jìn)作用在不同批次玉米樣品也中表現(xiàn)出了較大的差異性,如3號(hào)玉米樣品老玉米硒含量相對(duì)于嫩玉米僅增加了15.5%,而15號(hào)玉米樣品老玉米硒含量相對(duì)于嫩玉米增幅達(dá)3 692.31%,說(shuō)明生長(zhǎng)時(shí)間對(duì)不同種植地點(diǎn)玉米其硒含量增幅的影響存在較大差異。
由表3可知,蛋白是玉米中硒含量最高的組分,未檢出硒的玉米樣本其蛋白可檢出少量硒。嫩玉米蛋白中硒含量最高的為4號(hào)樣品,其含量硒為11.188 mg/kg;中位數(shù)為1號(hào)嫩玉米蛋白和16號(hào)嫩玉米蛋白樣品,其硒含量分別為1.513 mg/kg和1.476 mg/kg。老玉米蛋白中硒含量最高的為14號(hào)樣品,達(dá)17.009 mg/kg;中位數(shù)為1號(hào)老玉米蛋白和16號(hào)老玉米蛋白2.295 mg/kg 和1.754 mg/kg。
表3 不同產(chǎn)地玉米蛋白、多糖硒含量
玉米多糖中硒含量少于蛋白硒含量。其中嫩玉米多糖硒含量最高的為4號(hào)樣品,其含硒量為4.434 mg/kg;中位數(shù)為9號(hào)嫩玉米多糖和10號(hào)嫩玉米多糖樣品,其硒含量分別為0.158 mg/kg和0.160 mg/kg。老玉米多糖中硒含量最高的為14號(hào)樣品,其硒含量為7.763 mg/kg;中位數(shù)為5號(hào)老玉米多糖和16號(hào)老玉米多糖樣品,硒含量分別為0.987 mg/kg 和0.872 mg/kg。
總體而言,老玉米蛋白硒和多糖硒含量高于嫩玉米,且玉米中蛋白硒含量、多糖硒含量與總硒的變化趨勢(shì)較為一致,蛋白硒和多糖硒較高的樣品總硒含量也較高,反之亦然。說(shuō)明在不同產(chǎn)品批次中硒在蛋白和多糖中的賦存比例較為一致。相對(duì)于玉米籽粒而言,玉米蛋白和多糖均具有很高的含硒量,且玉米蛋白相較于多糖硒含量更高,提取更容易,故硒蛋白及以其為原料制備的硒多肽將是玉米中最具開(kāi)發(fā)潛力的含硒生物活性物質(zhì)。
由表2可知,不同玉米種植地區(qū)土壤樣本硒含量也存在一定差異,但其波動(dòng)性比玉米中硒含量波動(dòng)性小,5號(hào)地區(qū)土壤硒含量最高,為7.571 mg/kg,2號(hào)地區(qū)土壤硒含量最低,為0.800 mg/kg。富硒土壤標(biāo)準(zhǔn)為含量大于0.4 mg/kg[14],據(jù)此可知本研究采集的全部土壤樣本都達(dá)到了富硒土壤標(biāo)準(zhǔn)。
如表2所示,土壤樣本pH大多偏酸性,僅2、4、14共3個(gè)土壤樣本呈弱堿性。從表3可知,土壤pH與土壤硒含量之間并無(wú)明顯關(guān)系,但pH可能影響土壤中硒的存在形式[15]、土壤肥力、微生物活動(dòng)、有機(jī)質(zhì)的分解與合成等,從而影響玉米對(duì)硒的吸收。為了進(jìn)一步研究土壤因素對(duì)玉米中硒含量的影響,現(xiàn)計(jì)算與土壤樣品一同采集的16批老玉米樣品的硒富集系數(shù)并作圖(圖1)。
圖1 玉米硒富集系數(shù)與土壤pH值
由圖1可知,土壤pH與玉米硒富集系數(shù)有較強(qiáng)的相關(guān)性。其中在2、4、14號(hào)3個(gè)pH>7.00的弱堿性土壤樣本上生長(zhǎng)的玉米硒富集系數(shù)較高,這說(shuō)明堿性土壤環(huán)境有利于玉米對(duì)硒的吸收。4號(hào)樣品硒富集系數(shù)相對(duì)于2號(hào)和14號(hào)偏低可能是由于4號(hào)土壤樣本含硒量達(dá)5.062 mg/kg,遠(yuǎn)高于2號(hào)和14號(hào)土壤樣本的0.800 mg/kg和1.652 mg/kg的緣故;玉米作為一種非聚硒植物,其對(duì)硒的吸收能力有限,最終導(dǎo)致土壤中的硒呈過(guò)飽和狀態(tài),故硒富集系數(shù)有所下降。對(duì)于5、6、7、8、10、11 號(hào)土壤樣品,其pH 值在4.58~5.00之間,為所有樣品中土壤酸度最強(qiáng)的批次;而生長(zhǎng)在這些土壤樣本上的玉米對(duì)硒的富集系數(shù)也是所有樣品中最低的;這表明玉米在酸性環(huán)境中富集硒的能力受到了嚴(yán)重限制。其他pH值在5.00~7.00之間的土壤樣品對(duì)應(yīng)的玉米硒富集系數(shù)處于中等水平。
土壤pH是影響玉米硒富集能力的一個(gè)重要因素。通常認(rèn)為適宜玉米生長(zhǎng)的土壤pH范圍為5~8。本研究結(jié)果表明,可通過(guò)對(duì)富硒土壤進(jìn)行適當(dāng)堿化處理,使玉米中的硒含量大幅提升。不適宜的pH環(huán)境對(duì)K、Ca、Mg、S、P、N 等玉米生長(zhǎng)所需的各種元素的生物有效性均有負(fù)面影響,同時(shí)還可能影響土壤性質(zhì)、土壤微生物的活動(dòng)、肥料的利用率以及作物對(duì)養(yǎng)分的吸收[16]。另一方面,硒在土壤中的存在形式也是影響植物吸收的一個(gè)重要因素,土壤中的硒是以無(wú)機(jī)化合物的形式被植物吸收利用的。其中Se6+和Se4+都是植物較易于吸收的形式,但Se6+因具有較高的可溶性,更易被植物利用。在酸性與中性條件下,硒主要以Se4+形式存在。有研究表明,Se4+在酸性至近中性的土壤中易與鐵結(jié)合,形成難溶的復(fù)合物,這種復(fù)合作用會(huì)隨著pH的升高而降低,從而釋放出更多的Se4+[15]。同時(shí),隨著pH值的升高,更多的硒被氧化成Se6+形式,從而使硒的生物利用率大幅增加。因此,就提高玉米中硒的含量而言,必須選擇土壤弱堿性且土壤中硒含量達(dá)到富硒標(biāo)準(zhǔn)的種植地。
2.3.1 H2O2處理對(duì)HepG2細(xì)胞損傷的量效關(guān)系
如圖2所示,用100~800 μmol/L H2O2處理HepG2細(xì)胞2 h后,細(xì)胞存活率分別為86.65%、66.96%、66.31%、63.60%、60.91%,且H2O2濃度在200~600μmol/L范圍內(nèi)細(xì)胞存活率變化趨于平緩,故本研究采用400μmol/L H2O2處理作為細(xì)胞氧化損傷模型。
圖2 不同濃度H2 O2作用2 h對(duì)HepG2細(xì)胞存活率影響
2.3.2 CPs預(yù)處理對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
為了研究高硒和低硒CPs預(yù)處理對(duì)于細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用,本研究選用從恩施地區(qū)采集的樣品中硒含量最高(17.009 mg/kg)和最低(0.002 mg/kg)的2組蛋白樣品制成的CPs在H2O2損傷前先對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行24 h預(yù)處理,結(jié)果如圖3所示。
由圖3可知,經(jīng)不同濃度CPs預(yù)處理后的HepG2細(xì)胞存活率均有一定程度的上升,并表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。其中200、500、800μg/mL劑量的高硒CPs和500μg/mL劑量的低硒CPs均能極顯著(P<0.01)提高細(xì)胞存活率,且高硒CPs和低硒CPs組最佳預(yù)處理濃度均為500μg/mL。在有效濃度范圍內(nèi),相同劑量下的高硒CPs相對(duì)于低硒CPs細(xì)胞存活率有顯著提升(P<0.05),其中500μg/mL高硒CPs組細(xì)胞存活率提升達(dá)24.16%,說(shuō)明硒對(duì)玉米肽的活性有增效作用。
圖3 不同濃度CPs預(yù)處理對(duì)H2 O2損傷HepG2細(xì)胞的影響
生長(zhǎng)在魚(yú)塘壩附近不同區(qū)域的玉米硒含量存在較大差異,提前收獲的嫩玉米硒含量少于老玉米。玉米蛋白和多糖中硒含量均很高,具有良好的開(kāi)發(fā)利用潛力。本試驗(yàn)中16批玉米種植地土壤樣本均達(dá)到富硒土壤標(biāo)準(zhǔn)(>0.4 mg/kg),但大部分土壤偏酸性,僅3批土壤樣本呈弱堿性。土壤酸堿性影響玉米的硒富集能力有重大影響。酸性至近中性土壤不利于玉米對(duì)硒的吸收,玉米在弱堿性土壤中表現(xiàn)出對(duì)硒良好的吸收能力。高硒玉米和低硒玉米制成的玉米肽均表現(xiàn)出較好的抗氧化能力,在HepG2細(xì)胞抗氧化模型中500μg/mL濃度為玉米肽最佳抗氧化濃度,且高硒玉米肽抗氧化活性顯著高于低硒玉米肽,在該濃度下,經(jīng)過(guò)高硒玉米肽預(yù)處理的細(xì)胞存活率增加了24.16%。
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Study on Selenium Enrichment of Corn in Yutangba,Enshi and the Antioxidant Activity of the Corn Peptides
Wang Chi He Hui Zhang Jiuliang Hou Tao Shi Wen Liu Weiwei
(College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Key Laboratory of Environment Correlative Dietology Ministry of Education,Wuhan 430070)
In order to study the distributional characteristic of selenium in Yutangba,Enshi,the effects of soil on the selenium content of corn and the relationship between the selenium content and the antioxidant activity of corn peptides,the fine maize variety Xiangyu No.10 was chosen to be planted in 16 places near Yutangba and be collected in 2 seasons.Then,the selenium content of the corn,protein and polysaccharide in these corns was analyzed by the atomic fluorescent spectrometry.The selenium content and pH value of the soil samples collected from the cultivated fields were measured at the same time.The antioxidant capacities of high selenium CPs and low selenium CPs were researched according to the HepG2 body hepatoma cell model.The results showed that all the soil samples were up to the standard of selenium-enriched soil(0.4 mg/kg),however,the selenium content of the corns planted on these soils were quite different between each other,the selenium content,growing time and the pH value of the soil had combined impacts on the selenium enrichment of corn,and protein and polysaccharide in the corn had high selenium content.The corn peptides made by high selenium corn and low selenium corn showed a good antioxidant ability.While the former was significantly stronger(P <0.05),in the HepG2 cell model,the optimum antioxidant concentration of corn peptide was500 μg/mL;compared to processing group of lower selenium corn peptide,the cell viability preprocessed by high selenium corn peptide increased by 24.16%.In conclusion,the soil whose pH was below 5 had severe inhibiting effect on ability of corn absorbing selenium,the slightly alkaline soil was more suitable for the corn using selenium.The corns harvested later had a higher content of selenium;the antioxidant ability of corn peptides with high selenium level was significantly stronger than the ones with lower selenium level.
Yutangba,selenium-enriched corn,corn peptides,antioxidant activity,soil
Q514
A
1003-0174(2016)09-0075-06
國(guó)家自然科學(xué)基金(30972043),中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(2013PY095)
2015-01-15
王馳,男,1990年出生,碩士,食品化學(xué)
張久亮,男,1982年出生,副教授,天然活性成分研究與開(kāi)發(fā)