何榮海 邢 歡 劉 磊 王治平 馬海樂(lè)

液態(tài)發(fā)酵制備菜籽粕多肽的動(dòng)力學(xué)研究

何榮海 邢 歡 劉 磊 王治平 馬海樂(lè)

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院；江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心，鎮(zhèn)江 212013）

研究了枯草芽孢桿菌液態(tài)分批發(fā)酵菜籽粕的代謝特征，在分批發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S形，蛋白消耗曲線則呈反S形變化，多肽濃度在穩(wěn)定期32 h達(dá)到最高10.2 mg／mL。通過(guò)SPSS擬合Logistic方較好地描述了枯草芽孢桿菌正常液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)規(guī)律，擬合Luedeking-Piret方程1.068ln（0.99 ＋ 0.01e0.226t）描述了多肽生成的規(guī)律，S ＝ 14.430-＋ 0.566ln（0.99 ＋ 0.01e0.266t）描述了底物蛋白消耗的規(guī)律，模型驗(yàn)證中計(jì)算值與實(shí)測(cè)值的相對(duì)誤差絕大部分低于10%，較好反映了枯草芽孢桿菌分批發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)特征。

枯草芽孢桿菌 動(dòng)力學(xué)模型 液態(tài)發(fā)酵 菜籽粕

菜籽粕是菜籽榨油后剩下富含優(yōu)質(zhì)蛋白的大宗副產(chǎn)品，但由于在菜籽熱榨或溶劑提取制油的過(guò)程中，菜籽蛋白嚴(yán)重變性，制約了對(duì)菜籽粕的深度利用，目前一般僅用作飼料或肥料，造成蛋白資源的浪費(fèi)［1-2］。研究表明，以菜籽粕為底物，通過(guò)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶水解菜籽粕中的蛋白質(zhì)，并降解菜籽粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，可提高變性菜籽蛋白的生物利用度，制得具有良好功能特性且粗蛋白含量高的菜籽多肽［3-7］，是一種極具前景的菜籽粕深加工技術(shù)。枯草芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和科學(xué)研究［8］，利用枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕的研究報(bào)道不多，而有關(guān)枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)多肽過(guò)程的生長(zhǎng)特性、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析及模型研究文獻(xiàn)報(bào)道更少，這方面研究的不足阻礙了發(fā)酵菜籽粕制備多肽的技術(shù)應(yīng)用。

微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)包括細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、代謝產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)和基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)。通過(guò)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究和發(fā)酵模型的建立，能夠深入了解發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成的機(jī)制。對(duì)實(shí)現(xiàn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的模擬放大、發(fā)酵條件優(yōu)化與發(fā)酵過(guò)程自動(dòng)化控制，提高產(chǎn)物發(fā)酵指標(biāo)具有重要意義［9-11］。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的枯草芽孢桿菌為試驗(yàn)菌株，進(jìn)行菌株液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化研究，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了該菌的生長(zhǎng)規(guī)律、多肽生成及基質(zhì)蛋白消耗等動(dòng)力學(xué)研究，建立了描述發(fā)酵過(guò)程變化的動(dòng)力學(xué)曲線。通過(guò)動(dòng)力學(xué)曲線了解枯草芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程的代謝變化，獲得其動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型和模型參數(shù)，為進(jìn)一步放大試驗(yàn)，優(yōu)化和工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)化與控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

枯草芽孢桿菌W1-3（Bacillus subtilis），本實(shí)驗(yàn)室從鎮(zhèn)江恒順醋業(yè)股份有限公司提供的醋醅分離所得，北京諾賽基因公司鑒定；菜籽粕：江蘇省丹陽(yáng)市正大油脂有限公司，粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)33.14%；Gly-Gly-Tyr-Arg：Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

BS124S型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；YX280A型滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-1601型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京諾利分析儀器公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TGL-16型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；QYC-200型全溫空氣搖床：上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含1.0 g／100 mL 葡萄糖、1.0 g／100 mL酵母粉、0.5 g／100 mL 氯化鈉和2 g／100 mL 瓊脂，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：含1.0 g／100 mL 葡萄糖、1.0 g／100 mL 酵母粉、0.5 g／100 mL 氯化鈉，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：含5.0 g／75 mL菜籽粕，pH 7.0。

1.4 培養(yǎng)條件

將試驗(yàn)用菌種接到基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于30℃條件下恒溫靜止培養(yǎng)24 h，使菌種轉(zhuǎn)接活化。挑取3環(huán)活化后的枯草芽孢桿菌接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，棉塞封口，置于空氣搖床中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速180 r／min，培養(yǎng)24 h，得到試驗(yàn)用種子液。由培養(yǎng)好的菌懸液（菌體濃度為1×108個(gè)／mL），每瓶接種量為每瓶1.5 mL，培養(yǎng)基裝量75 mL／250 mL 三角瓶，36 ℃，180 r／min 搖床培養(yǎng)。

1.5 發(fā)酵液處理

將發(fā)酵產(chǎn)物取出，5 000 r／min條件下離心20 min，將上清液過(guò)濾后定容到同一體積（100 mL），保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 分析測(cè)定

1.6.1 枯草芽孢桿菌數(shù)量的測(cè)定［12］

采用血球板計(jì)數(shù)法測(cè)定。

1.6.2 多肽含量的測(cè)定［13］

取2 mL樣品溶液，加入2 mL 10%的三氯乙酸（TCA）水溶液，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置30 min，然后在10 000 r／min下離心10 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，并用5%的TCA定容至刻度，搖勻。取6 mL上述溶液置于試管中，加入雙縮脲試劑4 mL，于漩渦混合儀上混合均勻，靜置10 min，2 000 r／min 離心10 min，取上清液于540 nm下測(cè)定OD值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝0.152x＋0.052，R2＝0.999）對(duì)照計(jì)算得出樣品溶液中的多肽濃度。

1.6.3 游離氨基酸總量的測(cè)定［14］

吸取發(fā)酵處理液10 mL 2份，分別置于250 mL的錐形瓶中，加50 mL水，其中1份加入3滴中性紅指示劑（0.1%中性紅的50%乙醇溶液），用0.1 moL／L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至指示劑由紅色變成琥珀色（pH＝7.4）即為終點(diǎn)，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積V1。另1份加入20.0 mL 40%中性甲醛溶液和3滴百里酚酞指示劑（0.1%百里酚酞乙醇溶液），搖勻，靜置1 min，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至指示劑變?yōu)榈{(lán)色（pH＝10.0）即為終點(diǎn)，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積V2。

氨基酸態(tài)氮濃度（mg／mL）＝c×（V2-V1）×0.014×100

式中：c為NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度／mol／L；V1為中性紅為指示劑消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積／mL；V2為百里酚酞為指示劑消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積／mL；0.014 為氮的毫摩爾質(zhì)量／g／mmoL；100 為氨基酸態(tài)氮濃度轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1.6.4 底物剩余蛋白含量的計(jì)算

菜籽粕中的蛋白消耗用于菌株生長(zhǎng)和維持、多肽生成和游離氨基酸生成，菌株生長(zhǎng)而分泌的蛋白酶作用與蛋白質(zhì)而生成多肽和游離氨基酸，因此菌株生長(zhǎng)和維持所消耗的蛋白絕大部分轉(zhuǎn)變成了多肽和游離氨基酸，故蛋白含量可用菜籽粕中總蛋白量減去多肽和游離氨基酸的含量。

式中：M總為菜籽粕中總蛋白含量／mg；M1為多肽含量／mg；M2為游離氨基酸含量／mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程代謝變化特征

在分批發(fā)酵中，枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕代謝過(guò)程變化如圖1所示。

圖1 枯草芽孢桿菌分批發(fā)酵過(guò)程曲線

從圖1中可見(jiàn)，該菌生長(zhǎng)延遲期較短，發(fā)酵0～8 h，菌量增加不明顯，多肽基本不生成，蛋白消耗相對(duì)較少。8～28 h為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，菌體數(shù)明顯上升，多肽產(chǎn)量隨著菌體數(shù)上升而迅速增加，蛋白消耗明顯上升，蛋白量下降到640 mg。28～36 h為平穩(wěn)期，發(fā)酵液中蛋白量變化不明顯，菌量也幾乎不變，后期會(huì)下降，但多肽的濃度還繼續(xù)上升，32 h達(dá)到最高10.2 mg／mL。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程從菌體的緩慢生長(zhǎng)到達(dá)最高的菌體數(shù)9.845×109個(gè)／mL，多肽濃度從基本不生成到達(dá)最高的10.2 mg／mL（多肽得率高達(dá)20%），基質(zhì)蛋白從基本不變到最后基本耗完，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程菌體生長(zhǎng)代謝正常，多肽濃度達(dá)到優(yōu)化預(yù)測(cè)值，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程沒(méi)有異常，試驗(yàn)很成功，為以后動(dòng)力學(xué)模型的參數(shù)估算提供保障。

總體分析，枯草芽孢桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線為S形，蛋白消耗曲線則呈反S形變化，且多肽為菌體次級(jí)代謝產(chǎn)物，8～28 h多肽量隨細(xì)菌量的增加而增加，而多肽濃度的最高峰卻在穩(wěn)定期中出現(xiàn)，因此多肽的生成屬于生長(zhǎng)部分偶聯(lián)型［15］。

2.2 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

Logistic模型認(rèn)為微生物生長(zhǎng)速率不依賴物質(zhì)限制［16］。這種動(dòng)力學(xué)的限制因子是細(xì)胞濃度或生長(zhǎng)時(shí)間。Logistic模型是一個(gè)典型的S型曲線，能較好地反映分批發(fā)酵過(guò)程中因菌體濃度的增加對(duì)自身生長(zhǎng)存在的抑制作用，并能較好地?cái)M合分批發(fā)酵過(guò)程中的菌體生長(zhǎng)規(guī)律。因此，本研究采用該模型描述菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)，即

式中：X 為菌體數(shù)／109個(gè)／mL；μm為最大比生長(zhǎng)速率／109個(gè)／h；Xmax為菌體數(shù)最大值／109個(gè)／mL。

以方程（2）為自定義函數(shù)，用SPSS軟件進(jìn)行非線性擬合，擬合結(jié)果如圖2所示。

圖2 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)試驗(yàn)值與模型方程擬合曲線

式中：X0＝0.098；Xmax＝9.845；μm＝0.226；R2＝0.984。從圖2可發(fā)現(xiàn)，方程（3）的計(jì)算值與試驗(yàn)數(shù)據(jù)能較好地吻合。因此該方程較好的描述了枯草芽孢桿菌正常液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)規(guī)律，為優(yōu)化控制提供了參考。

2.3 多肽生成動(dòng)力學(xué)

產(chǎn)物主要指的是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中代謝生成的細(xì)胞量以外的產(chǎn)物。按照產(chǎn)物生成與菌體生長(zhǎng)的關(guān)系，可以分為3類。產(chǎn)物形成與菌體生長(zhǎng)偶聯(lián)型：只是在菌體生長(zhǎng)階段才有產(chǎn)物產(chǎn)生；產(chǎn)物形成與菌體生長(zhǎng)部分偶聯(lián)型：在菌體生長(zhǎng)階段有部分產(chǎn)物形成，而部分或大部分產(chǎn)物是在菌體處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期形成的；產(chǎn)物形成與菌體生長(zhǎng)非偶聯(lián)型：只要細(xì)胞存在產(chǎn)物就會(huì)生成。Luedeking-Piret方程是由Luedeking和Piret提出的用來(lái)描述產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)系的模型［17］：

當(dāng)α≠0，β＝0時(shí)，產(chǎn)物形成為生長(zhǎng)偶聯(lián)型；當(dāng)α＝0，β≠0時(shí)，產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)關(guān)；α≠0，β≠0，產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)部分偶聯(lián)。從圖1可知，多肽的生成屬于生長(zhǎng)部分偶聯(lián)型。通過(guò)數(shù)學(xué)求解得到積分式：

式中：P 為多肽濃度／mg／mL；P0為初始多肽濃度／mg／mL；α，β 為動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)；α為與菌體生長(zhǎng)率相關(guān)的產(chǎn)物形成率；βX為非伴隨菌體生長(zhǎng)的產(chǎn)物形成率。

以方程（5）為自定義函數(shù)，用SPSS軟件進(jìn)行非線性擬合，擬合結(jié)果如圖3所示。

圖3 多肽濃度試驗(yàn)值與模型方程擬合曲線

多肽濃度（P）隨時(shí)間變化的函數(shù)為

式中：P0＝1.974；α ＝1.255；β ＝ -0.023；R2＝0.974。β為負(fù)值，說(shuō)明多肽隨著菌株生長(zhǎng)而減少，分析其原因?yàn)榫攴置诘牡鞍酌笇⒉俗讯嚯倪M(jìn)一步水解成游離氨基酸，導(dǎo)致多肽含量的降低，從圖1中可知游離氨基酸濃度從32 h后急劇升高，因此模型準(zhǔn)確。從圖3中可知方程（6）與試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)能很好地?cái)M合，較好地描述了枯草芽孢桿菌正常液態(tài)發(fā)酵過(guò)程多肽生成情況。

2.4 底物蛋白消耗動(dòng)力學(xué)

在枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕過(guò)程中，菜籽粕中的蛋白主要用于菌株生長(zhǎng)、多肽生成、游離氨基酸生成和細(xì)胞的維持，多肽和氨基酸的生成是由于菌株生長(zhǎng)過(guò)程中釋放的酶作用于蛋白而生成，可看成菌株生長(zhǎng)的一部分，故蛋白消耗可用于Luedeking-Piret方程相似的方程式表示見(jiàn)式（7）。

通過(guò)數(shù)學(xué)求解得到積分式：

式中：S為底物蛋白剩余量／×100 mg；S0為初始底物蛋白剩余量／×100 mg；Yx／s為底物用于菌體生長(zhǎng)的得率常數(shù)；ms為微生物維持常數(shù)。

以方程（8）為自定義函數(shù)，用spss軟件進(jìn)行非線性擬合，擬合結(jié)果如圖4所示。

底物蛋白消耗量（S）隨時(shí)間變化的函數(shù)為

式中：S0＝14.316；Yx／s＝0.858；ms＝0.013；R2＝0.968。

從圖4中可知方程（9）與試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)能很好的擬合，較好地描述了枯草芽孢桿菌正常液態(tài)發(fā)酵過(guò)程底物蛋白消耗情況。

圖4 底物蛋白消耗試驗(yàn)值與模型方程擬合曲線

2.5 模型驗(yàn)證

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過(guò)SPSS軟件模擬所得枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)值見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)

為了所得模型能很好的描述正常發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、多肽生成和基質(zhì)蛋白消耗，在本試驗(yàn)條件下進(jìn)行其他發(fā)酵試驗(yàn)組，實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值比較結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，模型計(jì)算值與實(shí)測(cè)值的相對(duì)誤差絕大部分低于10%，擬合情況良好。雖然發(fā)酵前期（6～14 h）多肽生成模型方程曲線值與實(shí)測(cè)值誤差達(dá)到10%以上，但此時(shí)多肽濃度及變化不大，對(duì)以后菌體的生長(zhǎng)及發(fā)酵結(jié)果影響不大，因此該發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型方程能較好地反應(yīng)枯草芽孢桿菌正常液態(tài)發(fā)酵菜籽粕的發(fā)酵過(guò)程。

表2 試驗(yàn)值與模型計(jì)算值的比較

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)對(duì)枯草芽孢桿菌正常液態(tài)發(fā)酵菜籽粕發(fā)酵特征的分析，以及構(gòu)建Logistic和Luedeking-Piret方程，建立了描述發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、多肽生成和基質(zhì)蛋白消耗的動(dòng)力學(xué)模型，經(jīng)模型驗(yàn)證試驗(yàn)情況良好。本研究創(chuàng)新性地提出了復(fù)雜體系發(fā)酵底物中的某種成分消耗動(dòng)力學(xué)模型研究方法，并通過(guò)發(fā)酵中與該成分相關(guān)的代謝產(chǎn)物來(lái)推出該成分在發(fā)酵中的消耗情況，對(duì)以后復(fù)雜發(fā)酵底物的某種成分消耗動(dòng)力學(xué)的研究具有重要的參考價(jià)值。

3.2 本研究是在枯草芽孢桿菌正常發(fā)酵條件下，但微生物發(fā)酵過(guò)程的復(fù)雜性和影響因素的多變性，使所得發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型不能完全反映實(shí)際生產(chǎn)中的微生物發(fā)酵過(guò)程。因此，在今后實(shí)際應(yīng)用中需要對(duì)實(shí)際發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行多次優(yōu)化以及對(duì)所建模型進(jìn)行修正和補(bǔ)充，使模型更好更準(zhǔn)確地對(duì)實(shí)際發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行預(yù)測(cè)和控制。

3.3 就本試驗(yàn)而言，8～28 h是菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，是提高菌體濃度的最佳時(shí)期；從32 h以后多肽濃度下降，游離氨基酸大度上升，基質(zhì)蛋白幾乎耗完，菌體不再生長(zhǎng)。結(jié)合動(dòng)力學(xué)模型中微生物維持常數(shù)ms較低，用于菌體代謝（包括多肽的生成）的底物較少，因此如果要實(shí)現(xiàn)較高的菌體濃度和產(chǎn)肽水平可考慮采取中期（32 h左右）及后期補(bǔ)料。通過(guò)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究，對(duì)枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕有了進(jìn)一步的了解，對(duì)以后發(fā)酵過(guò)程的工藝控制、改進(jìn)和放大提供了理論指導(dǎo)。

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Study on Kinetics Model of Peptides Production by Liquid-State Fermentation from Rapeseed Meal

He Ronghai Xing Huan Liu Lei Wang Zhiping Ma Haile
（School of Food and Bioengineering，Jiangsu University／Jiangsu Key Laboratory of Agricultural Product Physical Processing／Jiangsu Province Research Center of Bio-process and Separation of Agri-products，Zhenjiang 212013）

The metabolic characters of Bacillus subtilis in liquid fermentation of rapeseed meal were studied.In the process of batch fermentation，the cell growth curve was S-shaped，protein consumption curve showed anti-S-shaped，and the polypeptide concentration reached the highest 10.2 mg／mL in the stable phase of 32 h.The growth law of the normal liquid fermentation process of Bacillus subtilis was described by the spss matching Logistic equationThe regularity of the formation of polypeptide was described by the Luedeking-Piret equation1.068ln（0.99 ＋0.01e0.226t），and the law of substrate protein consumption was described by the Luedeking-Piret equation＋ 0.566ln（0.99 ＋0.01e0.266t）.The relative error between the calculated and measured values was less than 10% ，which reflected the dynamic characteristics of the batch fermentation process of Bacillus subtilis.

bacillus subtilis，kinetic model，liquid-state fermentation，rapeseed meal

TS229

A

1003-0174（2016）09-0069-06

國(guó)家十二五科技支撐計(jì)劃（2013BAD10B03），國(guó)家星火計(jì)劃（2014GA690262），江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012708），江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（JAPP2010-9）

2015-01-14

何榮海，男，1971年出生，教授，農(nóng)產(chǎn)品深加工